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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 加酶切位点后扩增不出来了，在线求助
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笨笨的云

铜虫 (初入文坛)

[求助] 加酶切位点后扩增不出来了，在线求助

原来扩的很容易，加了酶切位点和保护碱基后就再也扩不出来了，各种方法都试过了，退火温度，体系改变，做touchdown也试过，就是扩不出来，快急死了，求助各位给点ideal！
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活到老学到老
1楼 2017-03-07 12:32:30
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

匿名

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8楼2017-03-08 09:35:22
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原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的模板是什么呢，基因组还是质粒？加了酶切位点后，是什么都扩增不出来，还是扩增出来但特异性不好？实在不行用比较笨的方法，你可以用不加酶切位点的引物扩增，然后连接T载体，然后提质粒，再用加酶切位点的引物来扩增。

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天空才是极限，我有信心飞的更高！
9楼2017-03-08 19:13:51
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
，你把你PCR的产物，用加了酶切位点的引物扩呗。
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采菊东篱下，悠然见南山。
4楼2017-03-07 16:53:43
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笨笨的云

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 781055707 at 2017-03-07 16:53:43
，你把你PCR的产物，用加了酶切位点的引物扩呗。

可以吗？师兄说PCR产物不能做模板，里面成分太多了，会影响扩增。我问过其他师兄，凡是做过的都没做出来。
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活到老学到老
5楼2017-03-07 20:35:58
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绝对零度的笑

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-03-08 07:40:33
你把PCR产物1:10稀释一下再取1ul做模板，50ul体系再P一次。PCR产物里面因为有大量剩余引物，会影响新的引物退火，你多稀释一下把旧的引物浓度降下来，应该就可以扩增了。
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6楼2017-03-08 00:24:02
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781055707

木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 笨笨的云 at 2017-03-07 20:35:58
可以吗？师兄说PCR产物不能做模板，里面成分太多了，会影响扩增。我问过其他师兄，凡是做过的都没做出来。...

可以的，不过你要把PCR产物纯化下，或跑个30个循环，取个0.1，0.2,0.3,0.4,0.5UL做模板，我做巢式PCR和重叠PCR用的都是PCR产物。做科研没有绝对的不能用，主要看方法和大胆的尝试。
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采菊东篱下，悠然见南山。
7楼2017-03-08 07:52:44
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普通回帖

匿名

用户注销 (著名写手)
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-03-08 07:40:15
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2楼2017-03-07 15:04:24
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笨笨的云

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by pf790352975 at 2017-03-07 15:04:24
确定所有东西和未加酶切位点和保护碱基的一样吗？
如果一样 那估计还要摸索下退火温度  适当降低

模板是一样的，加酶切位点后Tm值变高了，我从高到低摸索了很大的梯度，还是不行。
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活到老学到老
3楼2017-03-07 15:22:26
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笨笨的云

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 原海亮 at 2017-03-08 19:13:51
你的模板是什么呢，基因组还是质粒？加了酶切位点后，是什么都扩增不出来，还是扩增出来但特异性不好？实在不行用比较笨的方法，你可以用不加酶切位点的引物扩增，然后连接T载体，然后提质粒，再用加酶切位点的引物 ...

谢谢，实在不行就只能做T克隆了
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活到老学到老
10楼2017-03-09 08:59:32
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