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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 加酶切位点后扩增不出来了，在线求助
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笨笨的云

铜虫 (初入文坛)

[求助] 加酶切位点后扩增不出来了，在线求助

原来扩的很容易，加了酶切位点和保护碱基后就再也扩不出来了，各种方法都试过了，退火温度，体系改变，做touchdown也试过，就是扩不出来，快急死了，求助各位给点ideal！
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活到老学到老
1楼 2017-03-07 12:32:30
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781055707

木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 笨笨的云 at 2017-03-07 20:35:58
可以吗？师兄说PCR产物不能做模板，里面成分太多了，会影响扩增。我问过其他师兄，凡是做过的都没做出来。...

可以的，不过你要把PCR产物纯化下，或跑个30个循环，取个0.1，0.2,0.3,0.4,0.5UL做模板，我做巢式PCR和重叠PCR用的都是PCR产物。做科研没有绝对的不能用，主要看方法和大胆的尝试。
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采菊东篱下，悠然见南山。
7楼2017-03-08 07:52:44
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匿名

用户注销 (著名写手)
★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-03-08 07:40:15
本帖仅楼主可见
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2楼2017-03-07 15:04:24
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笨笨的云

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by pf790352975 at 2017-03-07 15:04:24
确定所有东西和未加酶切位点和保护碱基的一样吗？
如果一样 那估计还要摸索下退火温度  适当降低

模板是一样的，加酶切位点后Tm值变高了，我从高到低摸索了很大的梯度，还是不行。
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活到老学到老
3楼2017-03-07 15:22:26
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
，你把你PCR的产物，用加了酶切位点的引物扩呗。
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采菊东篱下，悠然见南山。
4楼2017-03-07 16:53:43
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