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huangts123

至尊木虫 (著名写手)

[求助] 同一蛋白在HPLC测的纯度>99%,而UPLC上出现峰裂分 已有1人参与

各位大神,下图是一个分子量约为80kD的蛋白,HPLC上检测的纯度为99.40%,峰型正常;UPLC上为什么会裂分? ①进样量为10ul,浓度约为0.81mg/ml,样品过载? ②蛋白是用注射用水溶的,会是溶样的溶剂效应导致的?③还是因为蛋白本身的原因!请各位大神多多指教,谢谢!

同一蛋白在HPLC测的纯度>99%,而UPLC上出现峰裂分
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llw1986

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【答案】应助回帖

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huangts123: 金币+10, ★★★很有帮助 2017-02-21 18:33:10
1. 你的强洗和弱洗用的什么?有没有放反了?
2. 如果怀疑过载了 这个是最好解决的,可以做几个稀释样品试一下就知道了,分别稀释10, 100, 1000等。直至不出现分叉
3. 溶剂效应的话可以用其实流动相组成来溶解样品
本身原因应该不太可能 毕竟你咋HPLC上出的峰没有分叉,当然不同仪器间出现差异也是可以理解的
3楼2017-02-21 17:09:38
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llx5262187

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2楼2017-02-21 16:06:20
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superyeast

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UPLC分辨率比HPLC高很多。在HPLC上分不开的在UPLC上能分开是正常的。

发自小木虫Android客户端
7楼2017-02-21 22:51:42
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llw1986

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15楼: Originally posted by huangts123 at 2017-02-22 18:08:13
您好,UPLC是借用别人的仪器(仪器上本来连有好多管子),我也是刚接触UPLC,只换了流动相,其他没有动过。请问灌洗液一般是什么溶剂?强洗和弱洗的管子上有什么标识?谢谢...

我不知道你们的仪器强洗和弱洗用的什么,一般都是乙腈和水。管子上应该是S和W吧,具体我也忘记啦
16楼2017-02-23 17:12:00
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llw1986

专家顾问 (正式写手)

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17楼: Originally posted by huangts123 at 2017-03-01 16:27:32
您好,如图所示,我通过减少进样量,稀释样品浓度,用流动相稀释样品,UPLC还是出双峰。好难过,难道是方法有问题?

UPLC.jpg
...

这么看感觉应该是两个物质 你打个质谱看看
18楼2017-03-01 17:06:24
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llw1986

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19楼: Originally posted by huangts123 at 2017-03-01 17:15:27
这个是蛋白质,分子量是一个范围,和化药不一样啊...

这就尴尬了 光看你图忘记你做的是蛋白了,突然想起个问题 你UPLC和HPLC用的是同一根柱子吗?
20楼2017-03-01 17:25:47
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llw1986

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21楼: Originally posted by huangts123 at 2017-03-02 08:08:45
不是的啊。HPLC用的是Symmetry300 C4 5um 4.6*250mm色谱柱;UPLC用的是BEH300 C4,1.7um,2.1*100mm色谱柱...

那就找到原因了 不同的色谱柱出峰不一样是可以理解的,UPLC的两个峰应该是两个物质 只是你用HPLC检测的时候用的那个柱子可能对其中一个不敏感 所以检测不到 而你换了UPLC的柱子能检测到的东西变多了 这是情有可原的。
22楼2017-03-02 11:33:56
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huangts123

至尊木虫 (著名写手)

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2楼: Originally posted by llx5262187 at 2017-02-21 16:06:20
过载的可能性最大,这个色谱柱一般进样量在2ul以下,浓度也不应该这么高。建议你稀释10倍,然后进样量降低。

如图所示,上图是UPLC流速为0.2ml/min的峰(同一样品),下图是发酵液(含有此蛋白质,浓度较低)流速为0.2ml/min的峰,下图的峰是不是可以看出此样品中浓度较低,但由于进样量大导致的?
同一蛋白在HPLC测的纯度>99%,而UPLC上出现峰裂分-1
oo.png

4楼2017-02-21 17:24:12
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huangts123

至尊木虫 (著名写手)

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3楼: Originally posted by llw1986 at 2017-02-21 17:09:38
1. 你的强洗和弱洗用的什么?有没有放反了?
2. 如果怀疑过载了 这个是最好解决的,可以做几个稀释样品试一下就知道了,分别稀释10, 100, 1000等。直至不出现分叉
3. 溶剂效应的话可以用其实流动相组成来溶解样 ...

1、如图中流动相所示,A:55%→40%; B:45%→60%;检查过没有放反; 2、如果样品浓度低,进样量大(10ul)会不会导致峰裂分; 3、样品为制剂液(主要为注射用水),怎样才能用流动相来溶(ps:用流动相稀释? 蛋白质在还有乙腈的流动相中会不会变性)
5楼2017-02-21 17:30:35
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huangts123

至尊木虫 (著名写手)

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2楼: Originally posted by llx5262187 at 2017-02-21 16:06:20
过载的可能性最大,这个色谱柱一般进样量在2ul以下,浓度也不应该这么高。建议你稀释10倍,然后进样量降低。

为什么不能给你金币啊
6楼2017-02-21 20:18:34
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superyeast

专家顾问 (职业作家)

8楼2017-02-21 22:52:13
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llx5262187

禁虫 (小有名气)

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9楼2017-02-21 23:24:01
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10楼2017-02-22 07:20:02
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