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huangts123

至尊木虫 (著名写手)

[求助] 同一蛋白在HPLC测的纯度>99%,而UPLC上出现峰裂分 已有1人参与

各位大神,下图是一个分子量约为80kD的蛋白,HPLC上检测的纯度为99.40%,峰型正常;UPLC上为什么会裂分? ①进样量为10ul,浓度约为0.81mg/ml,样品过载? ②蛋白是用注射用水溶的,会是溶样的溶剂效应导致的?③还是因为蛋白本身的原因!请各位大神多多指教,谢谢!

同一蛋白在HPLC测的纯度>99%,而UPLC上出现峰裂分
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huangts123

至尊木虫 (著名写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by llw1986 at 2017-02-21 17:09:38
1. 你的强洗和弱洗用的什么?有没有放反了?
2. 如果怀疑过载了 这个是最好解决的,可以做几个稀释样品试一下就知道了,分别稀释10, 100, 1000等。直至不出现分叉
3. 溶剂效应的话可以用其实流动相组成来溶解样 ...

1、如图中流动相所示,A:55%→40%; B:45%→60%;检查过没有放反; 2、如果样品浓度低,进样量大(10ul)会不会导致峰裂分; 3、样品为制剂液(主要为注射用水),怎样才能用流动相来溶(ps:用流动相稀释? 蛋白质在还有乙腈的流动相中会不会变性)
5楼2017-02-21 17:30:35
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llx5262187

禁虫 (小有名气)

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2楼2017-02-21 16:06:20
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llw1986

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
huangts123: 金币+10, ★★★很有帮助 2017-02-21 18:33:10
1. 你的强洗和弱洗用的什么?有没有放反了?
2. 如果怀疑过载了 这个是最好解决的,可以做几个稀释样品试一下就知道了,分别稀释10, 100, 1000等。直至不出现分叉
3. 溶剂效应的话可以用其实流动相组成来溶解样品
本身原因应该不太可能 毕竟你咋HPLC上出的峰没有分叉,当然不同仪器间出现差异也是可以理解的
3楼2017-02-21 17:09:38
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huangts123

至尊木虫 (著名写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by llx5262187 at 2017-02-21 16:06:20
过载的可能性最大,这个色谱柱一般进样量在2ul以下,浓度也不应该这么高。建议你稀释10倍,然后进样量降低。

如图所示,上图是UPLC流速为0.2ml/min的峰(同一样品),下图是发酵液(含有此蛋白质,浓度较低)流速为0.2ml/min的峰,下图的峰是不是可以看出此样品中浓度较低,但由于进样量大导致的?
同一蛋白在HPLC测的纯度>99%,而UPLC上出现峰裂分-1
oo.png

4楼2017-02-21 17:24:12
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