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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » CRISPR-Cas9基因突变
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nadia926499

木虫 (小有名气)

[求助] CRISPR-Cas9基因突变 已有1人参与

请问各位大神有木有用CRISPR-Cas9做悬浮细胞基因突变的？能否交流一下。
我用的是cas9蛋白和sgRNA组合的SNP直接与ssODN一起转染的细胞，用了脂质体转染（lipo2000）和电转（bio-rad电转仪，可能转染效率也不好）两种方式，各挑了2块96孔板，但是均没有阳性结果，花了2个月的时间，好难过。求助是不是中间有什么不对的地方？自己觉得大问题应该是转染效率很低，有没有什么好的方法可以借鉴的。或者包病毒？
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1楼 2017-01-17 12:06:14
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nadia926499

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by huafang_w at 2017-03-08 09:35:46
我也在做KI，是sgRNA-cas9质粒和DONOR双质粒电转，电转完GFP分选然后puro药筛1周以上，种单个细胞，克隆PCR测序，阳性率也很低的，种了10块板，挑了100多个克隆，只有两个单链KI的还不确定，所以定点KI好难做啊

我的这个突变基因还是个致死基因，所以能不能做出来我自己都怀疑了，这个东西真的是费时费力，加油啊

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3楼2017-03-09 00:08:05
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huafang_w

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
nadia926499: 金币+10 2017-03-09 00:06:58
我也在做KI，是sgRNA-cas9质粒和DONOR双质粒电转，电转完GFP分选然后puro药筛1周以上，种单个细胞，克隆PCR测序，阳性率也很低的，种了10块板，挑了100多个克隆，只有两个单链KI的还不确定，所以定点KI好难做啊
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2楼2017-03-08 09:35:46
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TyyVivian

新虫 (初入文坛)
楼主问题解决了吗？我用lipo2000转染的，96孔板有污染，但不是每个孔都污染了，怎么回事呢
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4楼2017-04-13 10:29:00
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