| 查看: 619 | 回复: 0 | |||
[交流]
CRISPR/Cas9入选2013《科学》杂志十大进展，仍难摆脱脱靶困扰
|
|
2013年，研究者们发表多篇文章介绍CRISPR/Cas9系统，但是CRISPR/Cas9目前仍存在一个很严重且无法避免的问题，即潜在的脱靶效应不可消除。 CRISPR/Cas9是由DNA切割酶Cas9和一段与靶 DNA片段匹配的20个核苷酸长度的短 RNA片段构成。它的特点在于只需合成一个gRNA就能实现对基因的特异性修饰，Cas9蛋白不具特异性；编码gRNA的序列不超过100bp，因此构建较简单方便。但是CRISPR/Cas9与靶位点识别的特异性主要依赖于gRNA与靠近PAM处10-12bp碱基的配对，而其余远离PAM处8-10bp碱基的错配对靶位点的识别影响不大。麻省理工的张峰等曾证实，在基因组的其他位置即使有某一个、连续两个或三个碱基与靶位点不同，gRNA也可以引导Cas9去切割，进而造成脱靶。同时麻省总医院的Jeffry D Sander证实，5个核苷酸的错配都可以引起脱靶位点的突变，突变率有可能和靶位点一样高，或甚至更高，进而研究人员需要在他们的实验中考虑这些潜在的混杂效应。混杂效应的存在一方面对细胞水平的打靶在基因功能的研究会造成混乱的局面，很难分析某功能的缺失是由哪个基因的敲除引起的，另一方面在动物模型应用中，CRISPR/Cas9的脱靶性尽管可以通过多代交配的方式稀释脱靶，但是这个过程会增加工作量和科研经费的开支，因此限制了CRISPR/Cas9的应用。 目前最常用的基因修饰技术有TALEN和CRISPR/Cas9两种。TALEN由TALE 蛋白和FokI 核酸内切酶组成，利用TALE的序列模块，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化组合蛋白，从而达到识别内源性基因的目的。CRISPR/Cas9是由CRISPR相关基因和Cas9基因组成，Cas9会在gRNA的指引下，在完整基因组上的特定位点完成切割反应，同时CRISPR/Cas9的切割也依赖于gRNA和基因组特定位点配对区5′端的PAM结构，这也限制了gRNA的设计。过去有些研究者尽管知道CRISPR/Cas9的脱靶严重，但是由于构建TALEN质粒步骤的繁琐使得他们还在TALEN和CRISPR/Cas9技术中徘徊，而现在FastTALE技术的出现使得TALEN质粒的构建可以很容易地在1天内完成，从而更能方便研究人员对TALEN技术的使用。 |
回复此楼» 猜你喜欢
散金
已经有68人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有65人回复
-
ALK5 高选择性小分子 LY-3200882：可放大合成路线与质控要点解析
已经有0人回复
-
AM630（CAS 164178-33-0）：CB2 选择性配体的实验使用与供应要点
已经有0人回复
-
ADC标杆分子T-DM1全解析：从结构设计到实验室应用的技术要点
已经有0人回复
-
HILIC磁珠研究蛋白组学怎么做？
已经有0人回复
-
His标签蛋白纯化怎么才能快？
已经有0人回复
-
WRN变构抑制剂HRO761：从D1/D2界面锁定到MSI合成致死的工具化合物深度解析
已经有0人回复
-
KRAS G12V(ON) 选择性抑制剂 RMC-5127：从三元复合物机制到科研应用
已经有0人回复
-
SHP2 变构抑制剂 Sitneprotafib：从作用机制到科研试剂选型要点
已经有0人回复
找到一些相关的精华帖子，希望有用哦~
点击这里搜索更多相关资源科研从小木虫开始，人人为我，我为人人
