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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 大神相助：cDNA克隆的测序结果和原模板不一致
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dalong1976

铜虫 (小有名气)

[求助] 大神相助：cDNA克隆的测序结果和原模板不一致 已有2人参与

各位坛友，现在我们根据GENBANK中已经登录的一个昆虫蛋白基因序列设计了引物，提取这种昆虫的总RNA，反转录CDNA，可是克隆的测序结果表明目前测通的10个克隆均与原序列不同，最好的结果也是差一个氨基酸，也有差三个的，并且都在保守结构域中；而且这10个克隆之间结果也都不相同。需不需要再送一部分克隆继续测序？还是在这10个结果中选择，选择的依据是什么吗？如果重新做，我们应该怎样优化条件？是什么原因导致的这个结果还是这个结果本来就是正常的？
请能力者指点迷津，多谢多谢！
对于有价值的回答我会赠与金币感谢，当然帮助者的初衷不会是为了金币，再次感谢。
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1楼 2017-01-12 12:56:33
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dalong1976

铜虫 (小有名气)
多些大家的帮助，有一些启发。真的是一个老虫子了，从原来读研就不断上论坛，到现在已经留校多年，繁琐的工作使得自己已经不常上论坛了，很怀念这里。对于第二个帮助者不知道怎么不能赠金币了，不过还是感谢！
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5楼2017-01-18 15:13:52
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bush119

木虫 (职业作家)

灌水高手

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
dalong1976: 金币+5, 多些指导！ 2017-01-18 15:05:01
问题有点多 我按问号顺序尽量帮你回答一下
1、不需要再送测序了，测序突变的根源在于PCR阶段有很大概率突变发生在扩增的前几个循环反应中，导致扩增的片段绝大多数为突变片段。
2、这10个结果中可以选择一个氨基酸序列比较接近参考序列的做定点突变，但是需要重新合成引物，做拼接，而且不能保证扩增结果不发生突变。
给你的建议是先做blast，看看是不是你提取RNA的虫子有什么变异。如果你的片段比较小，我猜应该不超过2000bp，不建议做定点突变，重新扩增一下试试。
3、重新做换个保真度高一点的酶，如果特异性好的话，适当降低一点退火温度，如果能排除你的模板不纯的因素。
4、这个结果正常，体外扩增，1000bp突变一个bp无可厚非，做的熟练以后4个克隆里面至少有一个是你要的。
5、有问题可以私信我
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2楼2017-01-12 13:39:51
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bush119

木虫 (职业作家)

灌水高手
刚看到 楼主是注册了十年的老虫子了
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3楼2017-01-12 13:41:32
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小静儿000

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
根据你的情况，我说一下可能存在的问题：
1.提取RNA的时候，提单头虫子的总RNA，进行反转录，看看是不是个体差异导致的突变。
2.确保你的PCR酶是高保真酶，比如诺唯赞的Phanta Max,保真度比较高，不会引进额外的突变。
3.和Genbank上下载的不完全相同这是有可能的，可能是不同地区的昆虫的基因多样性，但是你的这10个也都不相同是不正常的。建议重新进行扩增，可以换成同源重组的克隆方法进行克隆，比较简单而且实验耗时短，比如诺唯赞的ClonExpress II.
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4楼2017-01-12 14:30:04
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