应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 大神相助：cDNA克隆的测序结果和原模板不一致
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
51/1返回列表
查看: 1014  |  回复: 4
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

dalong1976

铜虫 (小有名气)

[求助] 大神相助：cDNA克隆的测序结果和原模板不一致 已有2人参与

各位坛友，现在我们根据GENBANK中已经登录的一个昆虫蛋白基因序列设计了引物，提取这种昆虫的总RNA，反转录CDNA，可是克隆的测序结果表明目前测通的10个克隆均与原序列不同，最好的结果也是差一个氨基酸，也有差三个的，并且都在保守结构域中；而且这10个克隆之间结果也都不相同。需不需要再送一部分克隆继续测序？还是在这10个结果中选择，选择的依据是什么吗？如果重新做，我们应该怎样优化条件？是什么原因导致的这个结果还是这个结果本来就是正常的？
请能力者指点迷津，多谢多谢！
对于有价值的回答我会赠与金币感谢，当然帮助者的初衷不会是为了金币，再次感谢。
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2017-01-12 12:56:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

bush119

木虫 (职业作家)

灌水高手

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
dalong1976: 金币+5, 多些指导！ 2017-01-18 15:05:01
问题有点多 我按问号顺序尽量帮你回答一下
1、不需要再送测序了，测序突变的根源在于PCR阶段有很大概率突变发生在扩增的前几个循环反应中，导致扩增的片段绝大多数为突变片段。
2、这10个结果中可以选择一个氨基酸序列比较接近参考序列的做定点突变，但是需要重新合成引物，做拼接，而且不能保证扩增结果不发生突变。
给你的建议是先做blast，看看是不是你提取RNA的虫子有什么变异。如果你的片段比较小，我猜应该不超过2000bp，不建议做定点突变，重新扩增一下试试。
3、重新做换个保真度高一点的酶，如果特异性好的话，适当降低一点退火温度，如果能排除你的模板不纯的因素。
4、这个结果正常，体外扩增，1000bp突变一个bp无可厚非，做的熟练以后4个克隆里面至少有一个是你要的。
5、有问题可以私信我
赞一下 回复此楼
2楼2017-01-12 13:39:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

bush119

木虫 (职业作家)

灌水高手
刚看到 楼主是注册了十年的老虫子了
赞一下 回复此楼
3楼2017-01-12 13:41:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小静儿000

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
根据你的情况，我说一下可能存在的问题：
1.提取RNA的时候，提单头虫子的总RNA，进行反转录，看看是不是个体差异导致的突变。
2.确保你的PCR酶是高保真酶，比如诺唯赞的Phanta Max,保真度比较高，不会引进额外的突变。
3.和Genbank上下载的不完全相同这是有可能的，可能是不同地区的昆虫的基因多样性，但是你的这10个也都不相同是不正常的。建议重新进行扩增，可以换成同源重组的克隆方法进行克隆，比较简单而且实验耗时短，比如诺唯赞的ClonExpress II.
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2017-01-12 14:30:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dalong1976

铜虫 (小有名气)
多些大家的帮助，有一些启发。真的是一个老虫子了，从原来读研就不断上论坛，到现在已经留校多年，繁琐的工作使得自己已经不常上论坛了，很怀念这里。对于第二个帮助者不知道怎么不能赠金币了，不过还是感谢！
赞一下 回复此楼
5楼2017-01-18 15:13:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 dalong1976 的主题更新
51/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 085410 一志愿211 22408分数359求调剂 +3 123456789qw 2026-03-31 4/200 2026-04-02 00:06 by 义文wang
[考研] 求调剂推荐 材料 304 +21 荷包蛋hyj 2026-03-26 21/1050 2026-04-01 21:09 by lijunpoly
[考研] 085601材料工程找调剂 +20 oatmealR 2026-03-29 21/1050 2026-04-01 21:00 by lijunpoly
[考研] 311求调剂 +11 蓝月亮亮 2026-03-30 11/550 2026-04-01 16:33 by 七度不信任
[考研] 350求调剂 +7 阿佳～ 2026-03-31 7/350 2026-04-01 16:12 by yanflower7133
[考研] 英一数二生物信息学287分，本科生物科学，求调剂 +3 碧水xyz 2026-03-29 4/200 2026-04-01 15:35 by plum
[考研] 求生物学调剂 +7 15172915737 2026-04-01 7/350 2026-04-01 15:27 by 闲人终南山
[论文投稿] chinese chemical letters英文版投稿求助 120+4 Yishengeryi 2026-03-30 5/250 2026-04-01 14:11 by 陆小果画大饼
[考研] 材料调剂 +10 Eujd1 2026-03-31 11/550 2026-04-01 11:23 by ivanqyq
[考研] 070300求调剂306分 +5 26要上岸 2026-03-27 5/250 2026-04-01 11:09 by oooqiao
[考研] 一志愿北京科技大学085601材料工程英一数二初试总分335求调剂 +5 双马尾痞老板2 2026-03-31 5/250 2026-04-01 09:04 by oooqiao
[考研] 289求调剂 +7 BrightLL 2026-03-29 7/350 2026-03-31 22:05 by 544594351
[考研] 复试调剂 +7 双马尾痞老板2 2026-03-31 7/350 2026-03-31 19:49 by Dyhoer
[考研] 一志愿南昌大学324求调剂 +6 hanamiko 2026-03-29 6/300 2026-03-31 16:35 by hypershenger
[考研] 一志愿中海洋材料357 +4 麦恩莉. 2026-03-30 4/200 2026-03-31 14:35 by 记事本2026
[考研] 081200-11408-276学硕求调剂 +4 崔wj 2026-03-31 4/200 2026-03-31 11:56 by jp9609
[考研] 266分，求材料相关专业调剂 +10 哇呼哼呼哼 2026-03-30 12/600 2026-03-31 11:00 by 熊一刀
[考研] 考研调剂 +5 Sanmu-124 2026-03-26 5/250 2026-03-30 13:36 by chemdavid
[考研] 085602 化学工程专硕 340分求调剂 +4 qianbai11 2026-03-29 4/200 2026-03-30 11:34 by 唐沐儿
[考研] 265求调剂 +8 小木虫085600 2026-03-27 8/400 2026-03-27 22:16 by 无际的草原
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭