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dalong1976铜虫 (小有名气)
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大神相助：cDNA克隆的测序结果和原模板不一致已有2人参与
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各位坛友，现在我们根据GENBANK中已经登录的一个昆虫蛋白基因序列设计了引物，提取这种昆虫的总RNA，反转录CDNA，可是克隆的测序结果表明目前测通的10个克隆均与原序列不同，最好的结果也是差一个氨基酸，也有差三个的，并且都在保守结构域中；而且这10个克隆之间结果也都不相同。需不需要再送一部分克隆继续测序？还是在这10个结果中选择，选择的依据是什么吗？如果重新做，我们应该怎样优化条件？是什么原因导致的这个结果还是这个结果本来就是正常的？ 请能力者指点迷津，多谢多谢！ 对于有价值的回答我会赠与金币感谢，当然帮助者的初衷不会是为了金币，再次感谢。 |
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
dalong1976: 金币+5, 多些指导！ 2017-01-18 15:05:01
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dalong1976: 金币+5, 多些指导！ 2017-01-18 15:05:01
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问题有点多 我按问号顺序尽量帮你回答一下 1、不需要再送测序了，测序突变的根源在于PCR阶段有很大概率突变发生在扩增的前几个循环反应中，导致扩增的片段绝大多数为突变片段。 2、这10个结果中可以选择一个氨基酸序列比较接近参考序列的做定点突变，但是需要重新合成引物，做拼接，而且不能保证扩增结果不发生突变。 给你的建议是先做blast，看看是不是你提取RNA的虫子有什么变异。如果你的片段比较小，我猜应该不超过2000bp，不建议做定点突变，重新扩增一下试试。 3、重新做换个保真度高一点的酶，如果特异性好的话，适当降低一点退火温度，如果能排除你的模板不纯的因素。 4、这个结果正常，体外扩增，1000bp突变一个bp无可厚非，做的熟练以后4个克隆里面至少有一个是你要的。 5、有问题可以私信我 |
2楼2017-01-12 13:39:51
3楼2017-01-12 13:41:32
4楼2017-01-12 14:30:04
dalong1976
铜虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
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- 虫号: 325362
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- 性别: MM
- 专业: 农业昆虫学
5楼2017-01-18 15:13:52