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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 谁会，想请教
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lijdoc
11楼2016-12-22 16:40:06
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peitaokong

银虫 (小有名气)
★ ★
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斑点windy: 金币+1 2016-12-22 17:40:02
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6楼: Originally posted by 斑点windy at 2016-12-22 15:58:12
两步法？为什么？
...

你不是说你能够扩出比较弱的条带。你可以采用两步法，第一步可以设置25个循环，然后用第一步的PCR产物为模板，然后再扩增第二次循环可以设置为30或者35个循环。这样起着富集模板的作用。可以针对基因丰度低的情况，更容易扩增。
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12楼2016-12-22 16:51:59
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sky蒲公英

版主 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主
★
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是pfu酶吗？感觉这个酶扩增效率还没有taq酶好，可以试着增大模板量，加倍都可以。

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知识就像蒲公英的花儿一样，播种在世界的每一个角落。
13楼2016-12-22 17:26:21
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斑点windy

铁虫 (著名写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by sukino at 2016-12-22 16:22:44
可能是酶的缓冲液成分不同？我看过文献说不同公司的酶在相同条件下扩增效果不同

嗯，takara的配套的，酶换了，我的缓冲液也相应的换了，就是扩不出来，要不用前面那个缓冲液试试？

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14楼2016-12-22 17:31:21
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Alice 2016

铁虫 (小有名气)
★ ★
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斑点windy: 金币+1 2016-12-22 17:41:07
重新换回之前的酶呀  
不过你可以尝试用一下诺唯赞的phanta max 我们实验室都在用这个，感觉挺不错的。
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怕什么真理无穷，进一寸有一寸的欢喜
15楼2016-12-22 17:33:21
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斑点windy

铁虫 (著名写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by peitaokong at 2016-12-22 16:51:59
你不是说你能够扩出比较弱的条带。你可以采用两步法，第一步可以设置25个循环，然后用第一步的PCR产物为模板，然后再扩增第二次循环可以设置为30或者35个循环。这样起着富集模板的作用。可以针对基因丰度低的情况， ...

嗯，我懂你的意思了，这也是加大产量的方法，但是，我现在只是摸索条件，就是设置了温度梯度，如果现在用两步法，我还有大量的样，那些该怎么办呢？万一有的样一点没有条带，怎么办呢？

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16楼2016-12-22 17:39:21
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斑点windy

铁虫 (著名写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by sky蒲公英 at 2016-12-22 17:26:21
是pfu酶吗？感觉这个酶扩增效率还没有taq酶好，可以试着增大模板量，加倍都可以。

就是taq酶

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17楼2016-12-22 17:39:46
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斑点windy

铁虫 (著名写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by Alice 2016 at 2016-12-22 17:33:21
重新换回之前的酶呀  
不过你可以尝试用一下诺唯赞的phanta max 我们实验室都在用这个，感觉挺不错的。

额，有在考虑，只是不好买就买了现在的

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18楼2016-12-22 17:40:57
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sukino

新虫 (正式写手)
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引用回帖:
14楼: Originally posted by 斑点windy at 2016-12-22 17:31:21
嗯，takara的配套的，酶换了，我的缓冲液也相应的换了，就是扩不出来，要不用前面那个缓冲液试试？
...

配套换了的话建议你把protocol再优化一下

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19楼2016-12-22 18:11:41
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peitaokong

银虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★
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斑点windy: 金币+5 2016-12-22 23:12:43
引用回帖:
16楼: Originally posted by 斑点windy at 2016-12-22 17:39:21
嗯，我懂你的意思了，这也是加大产量的方法，但是，我现在只是摸索条件，就是设置了温度梯度，如果现在用两步法，我还有大量的样，那些该怎么办呢？万一有的样一点没有条带，怎么办呢？
...

如果是扩增不出来的，那就要优化条件了。可以通过几个方面来调整，一个是镁离子的浓度。对于GC含量高的基因序列，可以选择加入GC buffer，当然退火温度也是需要考虑的。最后有条件的可以考虑换好一点儿酶，一般进口的酶，效果肯定要比国产的好些，无论是扩增效率，还是扩增的能力都要好些，当然价格肯定要比国产的贵一些。序列太长的可以考虑高保真酶。希望能够对你有所帮助。
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20楼2016-12-22 19:07:38
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