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WilliamHJ金虫 (小有名气)
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pSC101质粒在BL21（DE3）能正常复制吗？已有2人参与
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如题，楼主最近构建了一个质粒，大小约14000bp。这个质粒用的是PSC101质粒的复制子（pSC101 ori +Rep101蛋白，加上前后富余的序列共1500bp长），抗性基因截取了pUC19的AmpR基因区（长度约1100bp），剩下的序列主要是是色氨酸操纵子序列（约11500bp，还包括另外两个和色氨酸合成有关的基因）。用Gibson重组做好的质粒转入全式金的Trans-T1大肠杆菌感受态细胞，挑出阳性克隆经过菌液PCR和测序都是对的，带质粒的T1细胞在100ug/mL的Amp抗性平板上生长良好。但是用提出来的质粒去转化100uL BL21（DE3）感受态时却一个点都长不出来。 BL21（DE3）感受态是自己做的，而且这个菌种楼主之前用Kana基因代替了核DNA上的色氨酸酶基因（tnaA），当天做好感受态就用来做转化，同时做了一个阳性对照的转化（带trp操纵子的PBR322质粒，也有14000bp）。提取的质粒做过检测，40ng/ul左右，转了2uL。对照质粒转了1ul（200ng）。两管感受态都是冰浴30min后42度热激60s，加入900ul的 LB在37度复苏1小时，取200ul涂板。对照长出来满板，但是重组质粒一个点都没长出来。楼主之前用重组质粒转化W3110就能长出阳性克隆，但是转化子比较少。 请各位虫友帮楼主分析分析是什么原因，是不是pSC101复制子不适合带这么长的片段，还是说在BL21里需要特殊的处理？ |
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