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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » pSC101质粒在BL21（DE3）能正常复制吗？
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WilliamHJ

金虫 (小有名气)

[求助] pSC101质粒在BL21（DE3）能正常复制吗？ 已有2人参与

如题，楼主最近构建了一个质粒，大小约14000bp。这个质粒用的是PSC101质粒的复制子（pSC101 ori +Rep101蛋白，加上前后富余的序列共1500bp长），抗性基因截取了pUC19的AmpR基因区（长度约1100bp），剩下的序列主要是是色氨酸操纵子序列（约11500bp，还包括另外两个和色氨酸合成有关的基因）。用Gibson重组做好的质粒转入全式金的Trans-T1大肠杆菌感受态细胞，挑出阳性克隆经过菌液PCR和测序都是对的，带质粒的T1细胞在100ug/mL的Amp抗性平板上生长良好。但是用提出来的质粒去转化100uL BL21（DE3）感受态时却一个点都长不出来。
    BL21（DE3）感受态是自己做的，而且这个菌种楼主之前用Kana基因代替了核DNA上的色氨酸酶基因（tnaA），当天做好感受态就用来做转化，同时做了一个阳性对照的转化（带trp操纵子的PBR322质粒，也有14000bp）。提取的质粒做过检测，40ng/ul左右，转了2uL。对照质粒转了1ul（200ng）。两管感受态都是冰浴30min后42度热激60s，加入900ul的 LB在37度复苏1小时，取200ul涂板。对照长出来满板，但是重组质粒一个点都没长出来。楼主之前用重组质粒转化W3110就能长出阳性克隆，但是转化子比较少。
    请各位虫友帮楼主分析分析是什么原因，是不是pSC101复制子不适合带这么长的片段，还是说在BL21里需要特殊的处理？
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1楼 2016-12-14 14:30:04
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WilliamHJ

金虫 (小有名气)
补充一点，楼主忘了说，转化BL21(DE3)以后，涂板用的 LB平板Amp浓度是50ug/uL
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学习中
2楼2016-12-14 14:35:04
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执弦知意

新虫 (初入文坛)
露珠，求pSC101质粒，可以交换或者少量付费么？最近做实验需要用到这个，急求
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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

WilliamHJ
3楼2017-02-16 10:50:51
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qiannianchao

金虫 (初入文坛)
可否问下色氨酸是多少bp？
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4楼2017-05-22 11:02:51
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WilliamHJ

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 执弦知意 at 2017-02-16 10:50:51
露珠，求pSC101质粒，可以交换或者少量付费么？最近做实验需要用到这个，急求

对不住哦，刚刚看到的这个，我这里只有改造过得，还需要吗？

发自小木虫Android客户端
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5楼2017-05-23 08:45:39
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WilliamHJ

金虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by 执弦知意 at 2017-02-16 10:50:51
露珠，求pSC101质粒，可以交换或者少量付费么？最近做实验需要用到这个，急求

对不起哦，发了文以后就做成功了，没注意到您的回复。请问还需要吗？
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6楼2017-12-21 17:06:58
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Delia叮叮

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

楼主，您好，我最近也在构建11k的重组质粒，酶切胶回收后的载体和片段跑胶后条带大小都合适，用T4连接酶连接，感受态DH5a，转化是冰上30min，42度热击45s，220rpm复苏1h再图板，挑出来的克隆全部都是阴性，做了好长一段时间也没做出来，如果方便的您能给我分析一下吗
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7楼2018-04-15 23:41:57
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流水不争

铁杆木虫 (正式写手)

小木虫

【答案】应助回帖

pSC101 可以BL21存在的 建议楼主去测序看一下 pSC101和rep101序列 有没有突变 另外rep101要有独立的启动子启动才可以
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8楼2018-08-21 13:32:58
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