| 查看: 5667 | 回复: 7 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
WilliamHJ金虫 (小有名气)
|
[求助]
pSC101质粒在BL21（DE3）能正常复制吗？ 已有2人参与
|
|
|
如题，楼主最近构建了一个质粒，大小约14000bp。这个质粒用的是PSC101质粒的复制子（pSC101 ori +Rep101蛋白，加上前后富余的序列共1500bp长），抗性基因截取了pUC19的AmpR基因区（长度约1100bp），剩下的序列主要是是色氨酸操纵子序列（约11500bp，还包括另外两个和色氨酸合成有关的基因）。用Gibson重组做好的质粒转入全式金的Trans-T1大肠杆菌感受态细胞，挑出阳性克隆经过菌液PCR和测序都是对的，带质粒的T1细胞在100ug/mL的Amp抗性平板上生长良好。但是用提出来的质粒去转化100uL BL21（DE3）感受态时却一个点都长不出来。 BL21（DE3）感受态是自己做的，而且这个菌种楼主之前用Kana基因代替了核DNA上的色氨酸酶基因（tnaA），当天做好感受态就用来做转化，同时做了一个阳性对照的转化（带trp操纵子的PBR322质粒，也有14000bp）。提取的质粒做过检测，40ng/ul左右，转了2uL。对照质粒转了1ul（200ng）。两管感受态都是冰浴30min后42度热激60s，加入900ul的 LB在37度复苏1小时，取200ul涂板。对照长出来满板，但是重组质粒一个点都没长出来。楼主之前用重组质粒转化W3110就能长出阳性克隆，但是转化子比较少。 请各位虫友帮楼主分析分析是什么原因，是不是pSC101复制子不适合带这么长的片段，还是说在BL21里需要特殊的处理？ |
回复此楼» 猜你喜欢
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有127人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
-
留学--博士招生
已经有15人回复
-
化学工程，本211，求调剂，ab区不限
已经有4人回复
7楼2018-04-15 23:41:57
WilliamHJ
金虫 (小有名气)
- 应助: 8 (幼儿园)
- 金币: 2186.9
- 红花: 5
- 帖子: 170
- 在线: 58.5小时
- 虫号: 1858225
- 注册: 2012-06-13
- 性别: GG
- 专业: 生物物理、生物化学与分子
2楼2016-12-14 14:35:04
WilliamHJ3楼2017-02-16 10:50:51
4楼2017-05-22 11:02:51
