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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 双酶切连接转化平板长很多，但都是假阳性
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wy604987664

新虫 (小有名气)

[交流] 双酶切连接转化平板长很多，但都是假阳性

最近1个月做实验，每次构建表达载体平板上都是长很多单克隆，但送测后不是载体自连就是无信号。是载体没有完全切开？还是抗生素的问题？还是连接？
用赛默飞的快切酶，一般切40分钟左右。用的酶切位点也是平时常用的。以前用同样的酶切20分钟都没什么问题

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1楼 2016-12-09 18:02:14
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sky蒲公英

版主 (文坛精英)

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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-12-10 09:02:35
我也在做这个，酶切的话载体最好过夜，尽可能的酶切完全。还有转化的时候可以做个对照

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知识就像蒲公英的花儿一样，播种在世界的每一个角落。
2楼2016-12-09 23:14:35
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mochenmi

铜虫 (小有名气)
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-12-11 08:26:47
引用回帖:
4楼: Originally posted by 小蘑菇cc at 2016-12-10 00:14:37
最近做实验也有楼主遇到的问题 请问什么叫把载体切坏 是酶切时间过长嘛？
...

就是再仔细看看酶切位点是不是设计的合适，可能载体上还有另一个你用的酶切位点。
另外在pcr，提质粒甚至照紫外的时候都有可能发生突变，有一定概率形成一个酶切位点，这样载体就被切坏了。
如果老是做不出，建议重新提质粒再酶切，回收。不要一直用之前的回收产物做连接。

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10楼2016-12-10 12:04:24
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mochenmi

铜虫 (小有名气)
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-12-10 09:02:19
仔细再分析下酶切位点和切完后的片段大小，看是不是把载体切坏了。连接转化一般不会出问题的，刚做实验的新手也能成功。

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3楼2016-12-09 23:50:07
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往生花

至尊木虫 (文坛精英)
★
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假阳性多一般就是酶切效率低，双酶切自连多是不是有个酶不行或者都不行

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生而必争朝夕，活而必尽善美
6楼2016-12-10 04:21:48
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往生花

至尊木虫 (文坛精英)
抗生素的问题做个对照就行，

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生而必争朝夕，活而必尽善美
7楼2016-12-10 04:22:53
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往生花

至尊木虫 (文坛精英)
验证的时候也可以酶切验证

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生而必争朝夕，活而必尽善美
8楼2016-12-10 04:23:44
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迷路人啊

新虫 (小有名气)
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-12-11 08:26:25
两个酶分别单切看一下是不是酶坏了，还有就是你的两个酶切位点是不是离得很近？酶切结束是否胶回收？
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9楼2016-12-10 11:47:09
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普通回帖

小蘑菇cc

新虫 (初入文坛)
★
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引用回帖:
3楼: Originally posted by mochenmi at 2016-12-09 23:50:07
仔细再分析下酶切位点和切完后的片段大小，看是不是把载体切坏了。连接转化一般不会出问题的，刚做实验的新手也能成功。

最近做实验也有楼主遇到的问题 请问什么叫把载体切坏 是酶切时间过长嘛？

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4楼2016-12-10 00:14:37
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xatu666


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5楼2016-12-10 00:28:04
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