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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » [求助] 溶菌酶破碎大肠杆菌
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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humants

金虫 (正式写手)

[交流] [求助] 溶菌酶破碎大肠杆菌

我打算做蛋白提取，以前单纯用超声效果不好，为了尽量保留活性，选择用溶菌酶见超声破碎的方法。
  我按照分子克隆上的步骤：
  1.菌体称重为0.4g，加PBS buffer 3ml （PH=8.05），充分混匀。
  2.加现配的50mg/ml溶菌酶溶液240微升，至终浓度4mg/ml。冰水浴3小时。
  3.超声400w，10s，10s，40次，结果目测还是乳白色，镜检很多菌体。

为什么破不开，搞不懂，我前几天做预实验的时候，还能变澄清？？？
注：预实验的步骤与现在的一样，只是菌体重量是0.1g加PBS 3ml，再加溶菌酶至1mg/ml，超声400w，10s,10s, 20次。

麻烦大家能给以帮助，先谢谢了...

今天又做了一次，加完溶菌酶之后在4度中半小时，产生了乳白色絮状沉淀，还以为破碎好了呢，但是一超又变混了，1200rpm ，15min 离心之后沉淀发黄，和菌体差不多应该是没破开...？？？？

[ Last edited by humants on 2008-12-6 at 18:45 ]
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1楼 2008-12-04 08:49:37
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小小7093

★
humants(金币+1,VIP+0):谢谢你的帮助，这么久才评分不好意思，
菌体浓度过高，不利于破碎，可以试试：反复冻融
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10楼2008-12-06 12:43:57
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普通回帖

swordhang

金虫 (小有名气)
冰置3小时？
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2楼2008-12-04 12:33:24
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humants

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by swordhang at 2008-12-4 12:33:
冰置3小时？

写错了是冰水浴...
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3楼2008-12-04 18:51:36
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hxsj

木虫 (正式写手)
你的蛋白是上清表达还是包涵体？
我觉得可能超声时间不够
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4楼2008-12-04 23:26:51
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humants

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by hxsj at 2008-12-4 23:26:
你的蛋白是上清表达还是包涵体？
我觉得可能超声时间不够

跑过电泳，大部分是包涵体，所以打算用PBS破碎然后洗涤包涵体...
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5楼2008-12-05 08:17:07
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wusongabel

银虫 (初入文坛)
试试37度温浴班小时再冰水浴半小时
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6楼2008-12-05 10:01:02
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hxsj

木虫 (正式写手)
★
humants(金币+1,VIP+0):谢谢你的帮助，这么久才评分不好意思，
我做过的蛋白也是包涵体,采取的就是PBS破碎然后洗涤包涵体.我超声的条件是5S,5S.20MIN,大约是240次吧,感觉长时间超声对包涵体没什么太大破坏,反而是时间短会使破碎不完全,蛋白量少.
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7楼2008-12-05 15:30:08
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fkbp23

木虫 (小有名气)
★
humants(金币+1,VIP+0):谢谢你的帮助，这么久才评分不好意思，
我们破大肠杆菌的方法是37度，液氮反复冻融，两到三次后即可，效果很好。
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8楼2008-12-05 18:51:24
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shawcat

木虫 (正式写手)
★
humants(金币+1,VIP+0):谢谢你的帮助，这么久才评分不好意思，
溶菌酶在冰浴条件会有酶活么？

破不完全有很多原因的：有杂菌，菌体浓度过高，培养基的问题（我的菌用国产的胰蛋白胨和进口的差别很大）。
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9楼2008-12-06 10:43:35
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