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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 无缝克隆后平板不长菌落
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siyuansing

银虫 (小有名气)

[求助] 无缝克隆后平板不长菌落 已有3人参与

无缝克隆使用全式金的无缝克隆试剂盒，诺维赞的无缝克隆试剂盒，NEB的T4聚合酶，都效果甚微。
用全式金的试剂盒做出来过2个克隆，后来就无论怎么做都做不出来。就是平板上不长菌落，检查过引物，肯定没有问题，PCR扩增也很好。目的片段和载体的比例都是在2:1到3:1之间。目的片段2000kb，载体4000kb。不知道提高总的DNA量会不会有效果，请大家给个建议。
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1楼 2016-11-20 14:09:56
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glybacter

新虫 (初入文坛)
★
kuaile5420: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-11-23 20:50:33
同源臂设计的多长，载体是用PCR扩增的吗，还有载体和目的片段胶回收有没有？我最近这个研究的比较多，可以交流下
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2楼2016-11-20 16:35:19
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siyuansing

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by glybacter at 2016-11-20 16:35:19
同源臂设计的多长，载体是用PCR扩增的吗，还有载体和目的片段胶回收有没有？我最近这个研究的比较多，可以交流下

同源臂15bp，载体通过酶切线性化，都是胶回收。全式金的引物设计方案是把粘性末端算在同源臂上，有个同学说不能算粘性末端。两种方法都试过，做出来的那一次是前引物同源臂有粘性末端，后引物没有粘性末端。模板和目的基因的摩尔浓度比例基本都是1比2到1比3。今天把模板和目的基因都浓缩了，都是100多ng(刚从实验室回来，不记得具体的数据了)，模板加了2微，目的基因加了3微。不知道明天结婚怎么样。不知道兄台有什么经验可以传授的？非常感谢！

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3楼2016-11-20 22:14:33
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麦金城

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
或许并非你在载体和目的片段上出的问题，检查一下后面的步骤，祝你成功~~
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VERYWELL
5楼2016-11-21 20:52:54
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gastrodia

金虫 (正式写手)
同源臂设到20 -25，不要迷信试剂盒上面推荐的长度，

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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

siyuansing
6楼2016-11-22 08:13:49
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普通回帖

飞鸟向前

新虫 (初入文坛)
请问楼主解决了么？我也是做无缝克隆转化不成功（平板不长菌），已经试过两家公司的试剂盒了，快奔溃了。。
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4楼2016-11-21 13:29:41
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siyuansing

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 飞鸟向前 at 2016-11-21 13:29:41
请问楼主解决了么？我也是做无缝克隆转化不成功（平板不长菌），已经试过两家公司的试剂盒了，快奔溃了。。

我都做了几个月了，试过3种试剂盒了。不要放弃！

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7楼2016-11-24 08:22:17
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siyuansing

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by gastrodia at 2016-11-22 08:13:49
同源臂设到20 -25，不要迷信试剂盒上面推荐的长度，

好，我试一下，多谢！

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8楼2016-11-24 08:22:43
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荼蘼lyy

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

怎样能轻松的，快速的搞定载体克隆呢，你们有什么好方法吗？
我用的是这个试剂，把链接放上。有人用过吗？
怎样能轻松点快速的搞定载体克隆呢，你们有什么好方法吗？
我想试一下这个无缝克隆试剂盒。有人用过吗，效果怎么样啊？
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9楼2016-12-09 09:47:20
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siyuansing

银虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
6楼: Originally posted by gastrodia at 2016-11-22 08:13:49
同源臂设到20 -25，不要迷信试剂盒上面推荐的长度，

按你说的，已经做出来了，多谢啦！

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10楼2016-12-09 17:25:27
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