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siyuansing银虫 (小有名气)
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[求助]
无缝克隆后平板不长菌落 已有3人参与
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无缝克隆使用全式金的无缝克隆试剂盒，诺维赞的无缝克隆试剂盒，NEB的T4聚合酶，都效果甚微。 用全式金的试剂盒做出来过2个克隆，后来就无论怎么做都做不出来。就是平板上不长菌落，检查过引物，肯定没有问题，PCR扩增也很好。目的片段和载体的比例都是在2:1到3:1之间。目的片段2000kb，载体4000kb。不知道提高总的DNA量会不会有效果，请大家给个建议。 |
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siyuansing
银虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
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- 在线: 14.6小时
- 虫号: 2399997
- 注册: 2013-04-04
- 性别: GG
- 专业: 生物化学
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同源臂15bp，载体通过酶切线性化，都是胶回收。全式金的引物设计方案是把粘性末端算在同源臂上，有个同学说不能算粘性末端。两种方法都试过，做出来的那一次是前引物同源臂有粘性末端，后引物没有粘性末端。模板和目的基因的摩尔浓度比例基本都是1比2到1比3。今天把模板和目的基因都浓缩了，都是100多ng(刚从实验室回来，不记得具体的数据了)，模板加了2微，目的基因加了3微。不知道明天结婚怎么样。不知道兄台有什么经验可以传授的？非常感谢！ 发自小木虫IOS客户端 |
3楼2016-11-20 22:14:33
2楼2016-11-20 16:35:19
4楼2016-11-21 13:29:41
5楼2016-11-21 20:52:54
5
