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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 无缝克隆后平板不长菌落
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siyuansing

银虫 (小有名气)

[求助] 无缝克隆后平板不长菌落 已有3人参与

无缝克隆使用全式金的无缝克隆试剂盒，诺维赞的无缝克隆试剂盒，NEB的T4聚合酶，都效果甚微。
用全式金的试剂盒做出来过2个克隆，后来就无论怎么做都做不出来。就是平板上不长菌落，检查过引物，肯定没有问题，PCR扩增也很好。目的片段和载体的比例都是在2:1到3:1之间。目的片段2000kb，载体4000kb。不知道提高总的DNA量会不会有效果，请大家给个建议。
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1楼 2016-11-20 14:09:56
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siyuansing

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by glybacter at 2016-11-20 16:35:19
同源臂设计的多长，载体是用PCR扩增的吗，还有载体和目的片段胶回收有没有？我最近这个研究的比较多，可以交流下

同源臂15bp，载体通过酶切线性化，都是胶回收。全式金的引物设计方案是把粘性末端算在同源臂上，有个同学说不能算粘性末端。两种方法都试过，做出来的那一次是前引物同源臂有粘性末端，后引物没有粘性末端。模板和目的基因的摩尔浓度比例基本都是1比2到1比3。今天把模板和目的基因都浓缩了，都是100多ng(刚从实验室回来，不记得具体的数据了)，模板加了2微，目的基因加了3微。不知道明天结婚怎么样。不知道兄台有什么经验可以传授的？非常感谢！

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3楼2016-11-20 22:14:33
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glybacter

新虫 (初入文坛)
★
kuaile5420: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-11-23 20:50:33
同源臂设计的多长，载体是用PCR扩增的吗，还有载体和目的片段胶回收有没有？我最近这个研究的比较多，可以交流下
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2楼2016-11-20 16:35:19
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飞鸟向前

新虫 (初入文坛)
请问楼主解决了么？我也是做无缝克隆转化不成功（平板不长菌），已经试过两家公司的试剂盒了，快奔溃了。。
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4楼2016-11-21 13:29:41
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麦金城

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
或许并非你在载体和目的片段上出的问题，检查一下后面的步骤，祝你成功~~
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VERYWELL
5楼2016-11-21 20:52:54
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