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小李纸11

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[求助] 酵母电转效率低已有2人参与

重组质粒线性化后电击转化毕赤酵母，2100V，200欧，25微F，转化后涂YPSD（博莱霉素抗性）平板，第一次长了两个菌落，第二次一个都没长，整体转化效率极低，请问什么原因呢？

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1楼 2016-11-14 13:12:36

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云水栖心

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我的毕业实验的一部分和你一样，只是长得超级多。你的博莱霉素抗性浓度是多少啊？感受态是现制的吗？

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2楼2016-11-14 16:15:22

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小冀-

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【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1

是不是感受太的问题啊~电转之后加复苏液要快

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···

3楼2016-11-14 17:32:56

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小李纸11

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引用回帖:

2楼: Originally posted by 云水栖心 at 2016-11-14 16:15:22
我的毕业实验的一部分和你一样，只是长得超级多。你的博莱霉素抗性浓度是多少啊？感受态是现制的吗？

嗯嗯，感受态是现做的，博莱霉素浓度100微克每毫升。。。不知道是什么问题。感受态制备步骤如下：
(1) 感受态的制备：
a) 挑取酵母受体菌的单菌落接种于 10mLYPD 培养基中，30℃摇床过夜。
b) 以 1 %接种量转接 100mLYPD 液体培养基，30℃摇床过夜至 OD=1.3-1.5。
c) 4℃离心 5000rpm,5min,弃上清。
d) 用 100mL 冰预冷无均水将菌体重悬。
e) 4℃离心 5000rpm,10min,弃上清。
f) 用 50mL 冰预冷无均水将菌体重悬。
g) 4℃离心 5000rpm,10min,弃上清。
h) 再用 20mL 1 mol/L 的山梨醇洗涤 1 次
i) 溶于 200uL 1mol/L 的冰预冷的山梨醇，以备转化

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4楼2016-11-14 19:02:54

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小李纸11

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引用回帖:

3楼: Originally posted by 小冀- at 2016-11-14 17:32:56
是不是感受太的问题啊~电转之后加复苏液要快

哦哦，感受态是这么做的：
a) 挑取酵母受体菌的单菌落接种于 10mLYPD 培养基中，30℃摇床过夜。
b) 以 1 %接种量转接 100mLYPD 液体培养基，30℃摇床过夜至 OD=1.3-1.5。
c) 4℃离心 5000rpm,5min,弃上清。
d) 用 100mL 冰预冷无均水将菌体重悬。
e) 4℃离心 5000rpm,10min,弃上清。
f) 用 50mL 冰预冷无均水将菌体重悬。
g) 4℃离心 5000rpm,10min,弃上清。
h) 再用 20mL 1 mol/L 的山梨醇洗涤 1 次
i) 溶于 200uL 1mol/L 的冰预冷的山梨醇，以备转化

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5楼2016-11-14 19:04:36

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