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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR扩增结果有9个突变位点
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一起来旅行

银虫 (正式写手)

[求助] PCR扩增结果有9个突变位点 已有3人参与

我用的是地方猪的背最长肌的cDNA为模板，2?Taq MasterMix来扩增的CDS区，目的片段1121bp，再连t载体最后菌液pcr后去测序，结果与ncbi上的原始序列比对后，发现了9个突变位点，是不是有点多啊？

@biostar2009 @飞约疯人院 @wizardfan @youlinglyw 发自小木虫Android客户端
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1楼 2016-11-09 17:47:41
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

yuhan131481

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-11-11 07:16:47
1. 用2×Q5PCRmix或者KAPA HIFI PCRmix扩下试试，这两种酶的保真性是taq酶的100倍。
2. 把DNA序列翻译成氨基酸序列，比对下氨基酸序列，看看是不是同义突变。
3. 确定地方猪与文献的来源一样吗，会不会本来基因就有一定的差异，只不过该基因代表的蛋白功能是相似的。就是蛋白结构域是保守的，功能一样，基因序列有细微差别。
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4楼2016-11-09 18:06:03
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didongwei

金虫 (著名写手)
难道就没人考虑反转录本身造成的突变吗？

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不是优秀，而是不可替代
9楼2016-11-11 14:15:46
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werq63

金虫 (著名写手)
ncbi上blast一下

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10楼2016-11-11 18:48:16
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普通回帖

一起来旅行

银虫 (正式写手)
对了，测序结果的峰也是单峰

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2楼2016-11-09 17:49:09
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aliaaxmu2016

金虫 (职业作家)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-11-11 07:16:31
要看原始测序图AB1文件，就算他给你判读为txt文件了，你也要看，假如在两端有突变是不准确的，你要重新设计引物重新测那一段(末端)

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3楼2016-11-09 17:59:31
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一起来旅行

银虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by yuhan131481 at 2016-11-09 18:06:03
1. 用2×Q5PCRmix或者KAPA HIFI PCRmix扩下试试，这两种酶的保真性是taq酶的100倍。
2. 把DNA序列翻译成氨基酸序列，比对下氨基酸序列，看看是不是同义突变。
3. 确定地方猪与文献的来源一样吗，会不会本来基因就 ...

有五个为错意突变，还是有点多啊

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5楼2016-11-09 19:01:16
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iayala

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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kuaile5420: 金币+2, 欢迎发帖交流 2016-11-16 23:44:08
首先，T载菌液测序本身就会产生突变，建议多送几个克隆测序，看是否一样；
其次，个体差异是存在的，不同地域、品种的猪，DNA会有差异；
最后，5个氨基酸错义突变的解释，有没有这种可能：酶活位点在N端，而突变集中在中部或C端；总之，这种情况只能看酶活了，其它都是推测。
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6楼2016-11-10 14:06:23
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
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kuaile5420: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-11-16 23:44:17
不是相同样品，如果基因也不是很保守的，序列有差异很正常。要排除就是选择双向测序，以及多测几个样本。上下两条链测出来互补的，应该就是测正确了，多次出现的，可以把偶然的突变看作的PCR造成的。测序结果做BLAST，找最相似的比对，不要只跟开始选择来参考的比对。跟最相似的序列还有差异的，翻译看看出来的氨基酸是什么，通常亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸等相似氨基酸突变对蛋白功能影响不大，发生几率很大的，可以推测是样本来源的这种猪带有的突变，其他的氨基酸也看看是不是变成相似的。一般对这样的突变无需理会，如果是表达活性蛋白，就先表达测定看看也可以。
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为什么
7楼2016-11-11 00:31:36
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aliaaxmu2016

金虫 (职业作家)
建议重新设计引物再测一次，我这边测长片段都是分成好几段测的，避免把某个前段放在边缘测不准

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8楼2016-11-11 08:01:32
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