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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 我想做4个片段之间的融合，求高手指点
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549088894

新虫 (小有名气)

[求助] 我想做4个片段之间的融合，求高手指点 已有3人参与

我想做4个片段之间的融合，依据融合PCR设计四对引物，现在已经将4个片段扩增出来了，第一次将两个片段进行融合，1片段400多bp，2片段200多bp，第一步将1，2片段融合PCR，发现有好几条杂带，第二步分别用1-2片段融合回收产物、1-2片段融合未回收产物与片段3等体积混合，用酶，buffer，水补足25微升，不加引物，5个循环，后加入酶，buffer，水，引物，补足50微升，后扩增30循环，发现没有目的片段

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1楼 2016-11-07 19:52:28
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迷路人啊

新虫 (小有名气)
等摩尔比试试

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2楼2016-11-07 21:39:56
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hanxiaominhu

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
用In-Fusion的酶可以做多片段连接，我做过两个片段同时连入一个质粒的没问题，4个片段是不是可行我不清楚。和普通的连接只有设计引物时候不一样，而且基本不受酶切位点的限制。
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3楼2016-11-08 10:01:51
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匿名

用户注销 (初入文坛)
本帖仅楼主可见
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4楼2016-11-08 11:09:31
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
有同源壁，有时多个片段，可以买一下那个一部克隆试剂盒，一步就好了，我们在用，挺方便的
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···
5楼2016-11-09 10:41:25
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oylb

禁言 (正式写手)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽
6楼2016-11-09 10:56:33
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sun-ply

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by oylb at 2016-11-09 10:56:33
关键是第一第二个片段是否扩增成功。如果成功，后续问题不大；如果不成功，再做第三个就没必要了。建议根据pcr条带大小进行判断，另外取部分pcr产物送样测序确认是否成功。这个实验很简单，实在不顺利再考虑试剂盒
...

为什么前面的融合扩增循环是5到10个，而不是一般的30左右？

发自小木虫Android客户端
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7楼2016-11-09 14:49:27
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ft8122

新虫 (初入文坛)
用吉布森组装呀！

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8楼2016-11-09 15:21:56
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yakun123

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by oylb at 2016-11-09 10:56:33
关键是第一第二个片段是否扩增成功。如果成功，后续问题不大；如果不成功，再做第三个就没必要了。建议根据pcr条带大小进行判断，另外取部分pcr产物送样测序确认是否成功。这个实验很简单，实在不顺利再考虑试剂盒
...

前面的循环数设置为10，不加入酶吗，这步的目的是什么？
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9楼2016-11-10 15:30:43
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erryzhen

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
10楼2016-11-10 15:52:13
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