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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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549088894

新虫 (小有名气)

[求助] 我想做4个片段之间的融合,求高手指点 已有3人参与

我想做4个片段之间的融合,依据融合PCR设计四对引物,现在已经将4个片段扩增出来了,第一次将两个片段进行融合,1片段400多bp,2片段200多bp,第一步将1,2片段融合PCR,发现有好几条杂带,第二步分别用1-2片段融合回收产物、1-2片段融合未回收产物与片段3等体积混合,用酶,buffer,水补足25微升,不加引物,5个循环,后加入酶,buffer,水,引物,补足50微升,后扩增30循环,发现没有目的片段

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迷路人啊

新虫 (小有名气)

2楼2016-11-07 21:39:56
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hanxiaominhu

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
用In-Fusion的酶可以做多片段连接,我做过两个片段同时连入一个质粒的没问题,4个片段是不是可行我不清楚。和普通的连接只有设计引物时候不一样,而且基本不受酶切位点的限制。
3楼2016-11-08 10:01:51
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匿名

用户注销 (初入文坛)

本帖仅楼主可见
4楼2016-11-08 11:09:31
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
有同源壁,有时多个片段,可以买一下那个一部克隆试剂盒,一步就好了,我们在用,挺方便的
···
5楼2016-11-09 10:41:25
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oylb

禁言 (正式写手)

感谢参与,应助指数 +1
本帖内容被屏蔽

6楼2016-11-09 10:56:33
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sun-ply

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by oylb at 2016-11-09 10:56:33
关键是第一第二个片段是否扩增成功。如果成功,后续问题不大;如果不成功,再做第三个就没必要了。建议根据pcr条带大小进行判断,另外取部分pcr产物送样测序确认是否成功。这个实验很简单,实在不顺利再考虑试剂盒
...

为什么前面的融合扩增循环是5到10个,而不是一般的30左右?

发自小木虫Android客户端
7楼2016-11-09 14:49:27
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ft8122

新虫 (初入文坛)

用吉布森组装呀!

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8楼2016-11-09 15:21:56
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yakun123

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by oylb at 2016-11-09 10:56:33
关键是第一第二个片段是否扩增成功。如果成功,后续问题不大;如果不成功,再做第三个就没必要了。建议根据pcr条带大小进行判断,另外取部分pcr产物送样测序确认是否成功。这个实验很简单,实在不顺利再考虑试剂盒
...

前面的循环数设置为10,不加入酶吗,这步的目的是什么?
9楼2016-11-10 15:30:43
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erryzhen

禁虫 (小有名气)

本帖内容被屏蔽

10楼2016-11-10 15:52:13
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