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chase1024

木虫 (小有名气)

[求助] PCR扩增基因酶切位点丢失 已有2人参与

目的基因2600bp(无酶切位点)已连接至T载,上游引物59bp(带有酶切位点和RBS序列),下游引物30bp(带有酶切位点),扩增目的基因连接pMD19(simple),转化,菌落PCR验证,挑取阳性转化子送测序,测序结果显示只有目的基因(ATG开始,TAA结束),酶切位点均缺失,提取质粒酶切验证也不行,请问各位大神这是什么原因导致的?感激不尽。。。
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匿名

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5楼2016-10-29 22:18:08
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点点滴star

新虫 (初入文坛)

感觉就是没杂交上啊,是不是引物与探针出问题了

发自小木虫Android客户端
2楼2016-10-29 16:12:38
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chase1024

木虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 点点滴star at 2016-10-29 16:12:38
感觉就是没杂交上啊,是不是引物与探针出问题了

谢谢你的回复,以前我也做过此类实验,只不过目的片段只有750bp,每次测序结果都是正确的,也能切开,感觉找不到原因。
3楼2016-10-29 16:36:37
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点点滴star

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by chase1024 at 2016-10-29 16:36:37
谢谢你的回复,以前我也做过此类实验,只不过目的片段只有750bp,每次测序结果都是正确的,也能切开,感觉找不到原因。...

有时实验就这样,出不来结果,也找不到原因,加油 再多做几次试试吧

发自小木虫Android客户端
4楼2016-10-29 17:08:28
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
重新合成引物吧,引物有问题,没别的办法,重来

发自小木虫Android客户端
6楼2016-10-29 22:31:26
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生物技术专业

铁虫 (小有名气)

7楼2016-10-29 22:36:52
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寒冰利剑

金虫 (小有名气)

引物的问题,换个公司,重新合引物,用载体上通用引物测序,再看看

发自小木虫Android客户端
岂能尽如人意,但求无愧我心。
8楼2016-10-30 00:05:32
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chase1024

木虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 青蛙快飞 at 2016-10-29 22:18:08
感觉只是你酶切可能出问题,测序你是用正反向引物加设计引物拼接得到的结果吧?不然怎么刚好是你目的序列。

谢谢你的回复,测序引物是T载通用引物,酶切过程好像也没什么问题,就是很奇怪了为什么正好是我的目的片段
9楼2016-10-30 00:48:44
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chase1024

木虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by Neo2000 at 2016-10-29 22:31:26
重新合成引物吧,引物有问题,没别的办法,重来

引物已经换公司重新合成了,结果依旧如此
10楼2016-10-30 00:49:14
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