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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR扩增基因酶切位点丢失
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chase1024

木虫 (小有名气)

[求助] PCR扩增基因酶切位点丢失 已有2人参与

目的基因2600bp（无酶切位点）已连接至T载，上游引物59bp（带有酶切位点和RBS序列），下游引物30bp（带有酶切位点），扩增目的基因连接pMD19(simple)，转化，菌落PCR验证，挑取阳性转化子送测序，测序结果显示只有目的基因（ATG开始，TAA结束），酶切位点均缺失，提取质粒酶切验证也不行，请问各位大神这是什么原因导致的？感激不尽。。。
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1楼 2016-10-29 15:46:36
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匿名

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5楼2016-10-29 22:18:08
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点点滴star

新虫 (初入文坛)
感觉就是没杂交上啊，是不是引物与探针出问题了

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2楼2016-10-29 16:12:38
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chase1024

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 点点滴star at 2016-10-29 16:12:38
感觉就是没杂交上啊，是不是引物与探针出问题了

谢谢你的回复，以前我也做过此类实验，只不过目的片段只有750bp，每次测序结果都是正确的，也能切开，感觉找不到原因。
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3楼2016-10-29 16:36:37
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点点滴star

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by chase1024 at 2016-10-29 16:36:37
谢谢你的回复，以前我也做过此类实验，只不过目的片段只有750bp，每次测序结果都是正确的，也能切开，感觉找不到原因。...

有时实验就这样，出不来结果，也找不到原因，加油 再多做几次试试吧

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4楼2016-10-29 17:08:28
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
重新合成引物吧，引物有问题，没别的办法，重来

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6楼2016-10-29 22:31:26
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生物技术专业

铁虫 (小有名气)
加油

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7楼2016-10-29 22:36:52
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寒冰利剑

金虫 (小有名气)
引物的问题，换个公司，重新合引物，用载体上通用引物测序，再看看

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岂能尽如人意，但求无愧我心。
8楼2016-10-30 00:05:32
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chase1024

木虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 青蛙快飞 at 2016-10-29 22:18:08
感觉只是你酶切可能出问题，测序你是用正反向引物加设计引物拼接得到的结果吧？不然怎么刚好是你目的序列。

谢谢你的回复，测序引物是T载通用引物，酶切过程好像也没什么问题，就是很奇怪了为什么正好是我的目的片段
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9楼2016-10-30 00:48:44
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chase1024

木虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by Neo2000 at 2016-10-29 22:31:26
重新合成引物吧，引物有问题，没别的办法，重来

引物已经换公司重新合成了，结果依旧如此
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10楼2016-10-30 00:49:14
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