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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR扩增基因酶切位点丢失
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chase1024

木虫 (小有名气)
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7楼: Originally posted by 生物技术专业 at 2016-10-29 22:36:52
加油

谢谢
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11楼2016-10-30 00:49:29
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chase1024

木虫 (小有名气)
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8楼: Originally posted by 寒冰利剑 at 2016-10-30 00:05:32
引物的问题，换个公司，重新合引物，用载体上通用引物测序，再看看

谢谢你的回复，引物已经换公司合成了，但是结果依旧如此。
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12楼2016-10-30 00:50:06
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choujiaoqi

铁杆木虫 (知名作家)
扩增产物测序，对了再克隆到载体，再测序

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13楼2016-10-31 00:01:01
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choujiaoqi

铁杆木虫 (知名作家)
有可能扩增的时候是 非特异扩增，扩增的是别的剪辑体也有可能

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14楼2016-10-31 00:01:59
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ken19860823

木虫 (正式写手)
你的质粒模板不会也是psimple吧，如果是，你模板得加很少。取200ng以下加到1ml水然后取这里面的0.5到1ul做模板。

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做基因修饰的老菜鸡
15楼2016-10-31 07:36:33
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chase1024

木虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by ken19860823 at 2016-10-31 07:36:33
你的质粒模板不会也是psimple吧，如果是，你模板得加很少。取200ng以下加到1ml水然后取这里面的0.5到1ul做模板。

我的模板就是PMD19（simple），你以前也出现过这种现象吗？

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16楼2016-10-31 07:42:51
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可能引物有问题，你看看你送的引物有没有加上酶切位点
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···
17楼2016-10-31 08:49:03
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ken19860823

木虫 (正式写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by chase1024 at 2016-10-31 07:42:51
我的模板就是PMD19（simple），你以前也出现过这种现象吗？
...

没有。
只是你描述的一点漏洞没有，只能猜测你没描述的部分了。理论上pcr克隆到t载体上缺个把碱基，但是你这缺少太多了。所以我猜可能你没有切胶回收pcr片段就直接连了或者模板加的太多混到纯化的片段里。如果你测出来的序列和你原来模板一模一样就可以参考下我说的。

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做基因修饰的老菜鸡
18楼2016-10-31 13:15:39
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