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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 双酶切的目的基因与质粒连接无阳性菌怎么解决？
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鸢尾很辣

木虫 (正式写手)

[求助] 双酶切的目的基因与质粒连接无阳性菌怎么解决？ 已有4人参与

本人目的片段1200bp左右，PCR后胶回收产物&载体用Kpn I和Xba I双酶切37℃过夜，目的片段：载体比例10:1，16℃连接过夜，转化后一直没有长出阳性菌，请大家帮帮忙，看我哪里出现了问题。
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1楼 2016-10-20 19:37:37
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lemonvivi

新虫 (小有名气)
是不是都没有连接闪上，能把你链接加的具体东西说一下吗

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2楼2016-10-20 20:47:07
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lemonvivi

新虫 (小有名气)
片段与载体比例要以摩尔比而不是体积比哈

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3楼2016-10-20 20:48:11
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鸢尾很辣

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lemonvivi at 2016-10-20 20:48:11
片段与载体比例要以摩尔比而不是体积比哈

是浓度比的意思吗？我是否应该去测一个浓度，什么摩尔比比较恰当。
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4楼2016-10-20 21:30:35
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queen3511

铜虫 (小有名气)
你确定目的条带是酶切切好的吗？

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5楼2016-10-20 21:57:10
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lemonvivi

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 鸢尾很辣 at 2016-10-20 21:30:35
是浓度比的意思吗？我是否应该去测一个浓度，什么摩尔比比较恰当。...

这个是要测浓度的

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6楼2016-10-20 22:25:53
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banmaoyao

新虫 (初入文坛)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-10-23 22:17:50
做实验要有对照，才能分析出哪里的问题。你这样子说可能是比例问题，可能是连接问题，可能是转化问题等等都可能有问题

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7楼2016-10-21 10:41:34
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笑傲江鱼

新虫 (小有名气)
伙计，你这一步的前两步就是扩LB.RB吧，扩不出来有啥建议不

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8楼2016-10-21 10:43:57
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鸢尾很辣

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lemonvivi at 2016-10-20 20:47:07
是不是都没有连接闪上，能把你链接加的具体东西说一下吗

我加了5μl的目的片段，0.5μl的载体，1μl的buffer，1μl的T4连接酶，2.5μl的水，是NEB家的T4连接酶，16℃过夜。
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9楼2016-10-21 14:35:49
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鸢尾很辣

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by banmaoyao at 2016-10-21 10:41:34
做实验要有对照，才能分析出哪里的问题。你这样子说可能是比例问题，可能是连接问题，可能是转化问题等等都可能有问题

我个人觉得很有可能是比例问题，连接的话酶换过新的，转化应该也OK，公司的感受态和自己制得感受态都没有长出阳性菌，有什么具体办法吗？
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10楼2016-10-21 14:39:23
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