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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 双酶切的目的基因与质粒连接无阳性菌怎么解决？
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鸢尾很辣

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 笑傲江鱼 at 2016-10-21 10:43:57
伙计，你这一步的前两步就是扩LB.RB吧，扩不出来有啥建议不

延长你的摇菌时间，LB是无抗性的，不要加错
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11楼2016-10-21 14:40:05
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star013

新虫 (知名作家)
我们可以做基因克隆技术服务

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12楼2016-10-21 14:54:58
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可能没连上，酶切回收片段浓度高吗，pcr有没有杂带啥的？

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···
13楼2016-10-21 16:18:42
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D_gz

铜虫 (初入文坛)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-10-23 22:18:15
37度过夜酶切，时间太长了吧，我用NEB的内切酶一般37度2-4小时就能切的很干净。测浓度意义不大，虽然要求是摩尔比，但是你通过回收后电泳亮度能大致判断多大体积比合适。我们实验室都没法测核酸浓度，一直做连接也没啥问题。
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不做怎么知道。
14楼2016-10-21 16:29:52
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鸢尾很辣

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by lemonvivi at 2016-10-20 22:25:53
这个是要测浓度的
...

那能告诉我什么浓度比较恰当，摩尔比是多少转化效率最佳？
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15楼2016-10-21 16:47:46
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鸢尾很辣

木虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 小冀- at 2016-10-21 16:18:42
可能没连上，酶切回收片段浓度高吗，pcr有没有杂带啥的？

酶切片段没有测浓度，但是条带特别亮，也没有杂带。因为担心没有连上所以都是连接过夜的，不知道行不行，连接酶也是换的新的
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16楼2016-10-21 16:50:15
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鸢尾很辣

木虫 (正式写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by D_gz at 2016-10-21 16:29:52
37度过夜酶切，时间太长了吧，我用NEB的内切酶一般37度2-4小时就能切的很干净。测浓度意义不大，虽然要求是摩尔比，但是你通过回收后电泳亮度能大致判断多大体积比合适。我们实验室都没法测核酸浓度，一直做连接也没 ...

我之前用NEB的内切酶切了3个小时就直接切断了，现在用的takara家的内切酶，我连了T载体，所以可以看出两条带是切开的。此外，我也直接用PCR产物酶切，过夜是OK的。之前也做过载体构建，从未出现过这种问题，表示现在和懵圈哈
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17楼2016-10-21 16:52:51
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lemonvivi

新虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 鸢尾很辣 at 2016-10-21 16:47:46
那能告诉我什么浓度比较恰当，摩尔比是多少转化效率最佳？...

1:3-1:10

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18楼2016-10-21 17:58:15
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

引用回帖:
16楼: Originally posted by 鸢尾很辣 at 2016-10-21 16:50:15
酶切片段没有测浓度，但是条带特别亮，也没有杂带。因为担心没有连上所以都是连接过夜的，不知道行不行，连接酶也是换的新的...

连接过夜没问题的，那你在试试吧，不行就TA克隆

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···
19楼2016-10-21 18:15:36
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Gengli0909

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
1楼: Originally posted by 鸢尾很辣 at 2016-10-20 19:37:37
本人目的片段1200bp左右，PCR后胶回收产物&载体用Kpn I和Xba I双酶切37℃过夜，目的片段：载体比例10:1，16℃连接过夜，转化后一直没有长出阳性菌，请大家帮帮忙，看我哪里出现了问题。

会不会是胶回收产物浓度较低所以连接效率不高

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20楼2016-10-21 23:43:23
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