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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 双酶切的目的基因与质粒连接无阳性菌怎么解决？
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鸢尾很辣

木虫 (正式写手)
引用回帖:
26楼: Originally posted by cheng910323 at 2016-10-23 01:05:48
你用的感受态名称是什么

dh5a

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31楼2016-10-23 19:41:34
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鸢尾很辣

木虫 (正式写手)
引用回帖:
22楼: Originally posted by 514278815 at 2016-10-22 13:40:28
pcr不好切的，可以加一步ta克隆

ta克隆后也无阳性菌

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32楼2016-10-23 19:42:05
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鸢尾很辣

木虫 (正式写手)
引用回帖:
24楼: Originally posted by 几氧化氮 at 2016-10-22 16:35:20
会不会是载体XbaI甲基化导致载体没切动

这个该如何避免，求大神指点

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33楼2016-10-23 19:42:36
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鸢尾很辣

木虫 (正式写手)
引用回帖:
25楼: Originally posted by 弑者星魂 at 2016-10-23 00:05:12
没有阳性菌，我可以理解你平板上长的都是载体自连的阴性菌

这个该如何避免呢？求指点

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34楼2016-10-23 19:43:12
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鸢尾很辣

木虫 (正式写手)
引用回帖:
27楼: Originally posted by 不爱做实验 at 2016-10-23 13:18:40
酶切很关键，尝试酶切2-3h，不要过夜。同时注意酶切位点是否有重复
另外，连接比例的问题一般载体：目的片段=1：3即可，也可以提高比例

我担心比例太高，不过可以试试

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35楼2016-10-23 19:43:37
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cheng910323

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

内容已删除
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不语
36楼2016-10-23 21:35:49
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弑者星魂

金虫 (正式写手)
引用回帖:
34楼: Originally posted by 鸢尾很辣 at 2016-10-23 19:43:12
这个该如何避免呢？求指点
...

不好意思，没遇到过这种情况。今天刚做的构建，全是阳性的。我只能建议你增加酶切和链接的时间了

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37楼2016-10-23 21:43:43
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迷路人啊

新虫 (小有名气)
你是用的什么方法检测的呢？xbaI有可能甲基化导致酶切切不开   介意用pcr检测

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38楼2016-10-23 21:45:01
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514278815

木虫 (小有名气)
引用回帖:
32楼: Originally posted by 鸢尾很辣 at 2016-10-23 19:42:05
ta克隆后也无阳性菌
...

ta不是有蓝白筛选吗？如果没有只能说明pcr就出了问题

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39楼2016-10-23 22:46:08
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不爱做实验

银虫 (正式写手)
引用回帖:
35楼: Originally posted by 鸢尾很辣 at 2016-10-23 19:43:37
我担心比例太高，不过可以试试
...

不高，目的片段的量可以再增加
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40楼2016-10-24 08:55:38
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