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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » 基因敲除后的互补实验
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董红红

铜虫 (小有名气)

[求助] 基因敲除后的互补实验

实验室师兄已经利用同源重组的方式通过PEG介导的原生质体转化方法成功将一个基因敲掉了，并且通过了PCR及southern验证是正确，现在我需要接着做互补，我看文献正在构建了互补载体，但我对后面的实验有所困惑，我要是互补载体构建好了，然后我用敲掉的基因的转化子做原生质体，之后我是直接把互补载体导入原生质体吗？还是要将互补载体酶切或者什么的？原理是什么呢？希望懂得的大神帮我解答一下，不胜感激

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1楼 2016-10-04 21:10:33
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longevens

新虫 (初入文坛)
您好，请问楼楼，我最近也在做原生质体，我的原因是在原生质体离心这一方面，8000转离心3分钟，直接倾倒，然后镜检酶解上清液，发现上清液还是有很多的原生质体。然后再次用0.7NaCl清洗离心，倾倒上清液，然后再镜检就只有一点点原生质体了根本不够做转化，楼楼请问你是怎么处理上清液的呢？我现在都不敢倒了。还有你每次是做多少体系的呢？我是做的10ml得酶解体系；还有为什么我在用STC悬浮的时候溶液会变成乳白色呢（STC溶液是澄清的，配方跟大众一样）？离心完了就成了白色粘稠沉淀，镜检完全看不到原生质体了，感觉被裹住了。非常希望您的帮助。
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Bequiet
2楼2017-08-10 17:06:28
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rabbit12510

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by longevens at 2017-08-10 17:06:28
您好，请问楼楼，我最近也在做原生质体，我的原因是在原生质体离心这一方面，8000转离心3分钟，直接倾倒，然后镜检酶解上清液，发现上清液还是有很多的原生质体。然后再次用0.7NaCl清洗离心，倾倒上清液，然后再镜检 ...

请问你的问题最后是怎么解决的呀？我现在也出现这种情况，离心后原生质体特别少，加入STC悬浮后，溶液变成乳白色。镜检发现有很多破碎的菌丝体
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3楼2018-11-25 09:47:24
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