24小时热门版块排行榜    

查看: 1561  |  回复: 11

苓宁988

新虫 (小有名气)

[求助] 真核表达 已有1人参与

克隆病毒的某个非结构蛋白后做真核表达,一直不顺利!这是我最近连接pCAGGS后的一个重组质粒,酶切和测序都正确,转染293T细胞后做的IFA,标签是Flag,但是不明白为什么我的蛋白表达看着不是在细胞质,而且感觉这么不太正常呢?明年要毕业了,实验还是不顺利,急死了,希望大神指导,谢谢!

真核表达
4ug-4.jpg
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

ttszero

新虫 (小有名气)


西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-09-21 22:49:01
光定位还有其他么?你用标签抗体免疫荧光?我一般目的蛋白抗体做,不知道有没有差异,就算你裂解细胞做wb,flag一抗还是拉下很多杂带,感觉不太可信

发自小木虫IOS客户端
7楼2016-09-21 22:45:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

star013

新虫 (知名作家)


我们公司可以提供该技术服务

发自小木虫Android客户端
2楼2016-09-20 14:23:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

苓宁988

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by star013 at 2016-09-20 14:23:26
我们公司可以提供该技术服务

请问是什么公司?
3楼2016-09-20 14:40:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

star013

新虫 (知名作家)


北京艾普希隆生物科技有限公司

发自小木虫Android客户端
4楼2016-09-20 14:54:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

苓宁988

新虫 (小有名气)

自己顶一下!
5楼2016-09-21 08:34:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ConnConn

新虫 (著名写手)

除了定位你还有别的数据吗,比如互作蛋白或者共定位?有些病毒蛋白定位亚细胞结构的!

发自小木虫Android客户端
6楼2016-09-21 22:29:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

苓宁988

新虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by ttszero at 2016-09-21 22:45:50
光定位还有其他么?你用标签抗体免疫荧光?我一般目的蛋白抗体做,不知道有没有差异,就算你裂解细胞做wb,flag一抗还是拉下很多杂带,感觉不太可信

帖子中的图片是用标签Flag的抗体做的荧光。做WB时,用Flag做一抗,确实显色时有很多杂带。还有一个问题是,别人转染后观察细胞都能看到质粒和脂质体的混合物(小点样的东西),但我的转染后却观察不到,这种情况是不是也会影响转染效率,是什么原因呢? PS:质粒提取用的是OMEGA去内毒素的试剂盒。
8楼2016-09-22 10:02:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

苓宁988

新虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by ConnConn at 2016-09-21 22:29:55
除了定位你还有别的数据吗,比如互作蛋白或者共定位?有些病毒蛋白定位亚细胞结构的!

我现在想先确定这个蛋白能否表达成功,然后再进行蛋白互作实验呢,所以别的数据基本没有。有个情况就是,我的这个基因连接到pCAGGSS上加大转染剂量能观察到上图结果,但是换个基因(相同病毒的另外的非结构蛋白基因)转染,IFA结果还不如上图,甚至就直接没有。期间也换过pEGFP-C1载体(重组质粒测序、酶切都对),但是结果还是不行,不知道怎么回事?
    还有一个问题是,别人转染后观察细胞都能看到质粒和脂质体的混合物(小点样的东西),但我的转染后却观察不到,这种情况是不是会直接影响了转染,导致质粒基本就没有进入细胞啊?
9楼2016-09-22 10:10:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

匿名

用户注销 (著名写手)

感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 应助指数-1, 无应助 2016-09-22 22:24:01
本帖仅楼主可见
10楼2016-09-22 22:08:13
已阅   申请MolEPI   回复此楼   编辑   查看我的主页
相关版块跳转 我要订阅楼主 苓宁988 的主题更新
信息提示
请填处理意见