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苓宁988

新虫 (小有名气)

[求助] 真核表达 已有1人参与

克隆病毒的某个非结构蛋白后做真核表达，一直不顺利！这是我最近连接pCAGGS后的一个重组质粒，酶切和测序都正确，转染293T细胞后做的IFA，标签是Flag，但是不明白为什么我的蛋白表达看着不是在细胞质，而且感觉这么不太正常呢？明年要毕业了，实验还是不顺利，急死了，希望大神指导，谢谢！

真核表达
4ug-4.jpg
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1楼 2016-09-20 11:40:58
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ttszero

新虫 (小有名气)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-09-21 22:49:01
光定位还有其他么？你用标签抗体免疫荧光？我一般目的蛋白抗体做，不知道有没有差异，就算你裂解细胞做wb，flag一抗还是拉下很多杂带，感觉不太可信

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7楼2016-09-21 22:45:50
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star013

新虫 (知名作家)
我们公司可以提供该技术服务

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2楼2016-09-20 14:23:26
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苓宁988

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by star013 at 2016-09-20 14:23:26
我们公司可以提供该技术服务

请问是什么公司？
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3楼2016-09-20 14:40:43
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star013

新虫 (知名作家)
北京艾普希隆生物科技有限公司

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4楼2016-09-20 14:54:23
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苓宁988

新虫 (小有名气)
自己顶一下！
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5楼2016-09-21 08:34:47
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ConnConn

新虫 (著名写手)
除了定位你还有别的数据吗，比如互作蛋白或者共定位？有些病毒蛋白定位亚细胞结构的！

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6楼2016-09-21 22:29:55
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苓宁988

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by ttszero at 2016-09-21 22:45:50
光定位还有其他么？你用标签抗体免疫荧光？我一般目的蛋白抗体做，不知道有没有差异，就算你裂解细胞做wb，flag一抗还是拉下很多杂带，感觉不太可信

帖子中的图片是用标签Flag的抗体做的荧光。做WB时，用Flag做一抗，确实显色时有很多杂带。还有一个问题是，别人转染后观察细胞都能看到质粒和脂质体的混合物（小点样的东西），但我的转染后却观察不到，这种情况是不是也会影响转染效率，是什么原因呢？ PS：质粒提取用的是OMEGA去内毒素的试剂盒。
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8楼2016-09-22 10:02:47
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苓宁988

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by ConnConn at 2016-09-21 22:29:55
除了定位你还有别的数据吗，比如互作蛋白或者共定位？有些病毒蛋白定位亚细胞结构的！

我现在想先确定这个蛋白能否表达成功，然后再进行蛋白互作实验呢，所以别的数据基本没有。有个情况就是，我的这个基因连接到pCAGGSS上加大转染剂量能观察到上图结果，但是换个基因（相同病毒的另外的非结构蛋白基因）转染，IFA结果还不如上图，甚至就直接没有。期间也换过pEGFP-C1载体（重组质粒测序、酶切都对），但是结果还是不行，不知道怎么回事？
    还有一个问题是，别人转染后观察细胞都能看到质粒和脂质体的混合物（小点样的东西），但我的转染后却观察不到，这种情况是不是会直接影响了转染，导致质粒基本就没有进入细胞啊？
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9楼2016-09-22 10:10:56
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匿名

用户注销 (著名写手)
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 应助指数-1, 无应助 2016-09-22 22:24:01
本帖仅楼主可见
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10楼2016-09-22 22:08:13
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