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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸杂交 » 求助，双酶切
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Yuanfang_818

金虫 (小有名气)

[求助] 求助，双酶切 已有4人参与

各位道友，我将2000bp的片段插入到pET-32a中，然后双酶切，电泳只有4000和7000之间，有一条带，估计是32a的5900大小，没有2000的目的条带。怎么回事？我验证过质粒，电泳在5000多，准备跑PCR再验证一下。问题只有质粒吗，还有没有别的原因啊。求教！

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1楼 2016-08-30 13:04:49
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xuegyx

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Yuanfang_818: 金币+3, ★★★很有帮助 2016-08-31 23:10:59
xn8008: 金币+1, 应助指数+1, 欢迎发帖交流 2016-09-01 08:26:09
可能的原因有：1，目的基因根本没有插入到质粒中；2，双酶切用的酶是只有一种有活性或只有一种酶的酶切位点还有保留；3，酶切用的质粒量太少，目的片段量太少而检测不到
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2楼2016-08-30 16:03:13
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Yuanfang_818

金虫 (小有名气)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-09-01 08:26:42
引用回帖:
2楼: Originally posted by xuegyx at 2016-08-30 16:03:13
可能的原因有：1，目的基因根本没有插入到质粒中；2，双酶切用的酶是只有一种有活性或只有一种酶的酶切位点还有保留；3，酶切用的质粒量太少，目的片段量太少而检测不到

第一，提取的质粒，我重新跑PCR，有目的片段，说明片段连进去了，质粒没问题。第二，我觉得质粒没有切开，因为之前我提取的质粒，跑电泳，片段也在5000多，我估计和32a的5900差不多，电泳区分不开。第三，我的酶切体系是50微升的，两种酶各加了1和2微升，质粒共加了1500ng，酶切了5个小时。

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3楼2016-08-30 21:14:13
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Yuanfang_818: 金币+3, ★★★很有帮助 2016-08-31 23:11:19
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-09-01 08:26:50
引用回帖:
3楼: Originally posted by Yuanfang_818 at 2016-08-30 21:14:13
第一，提取的质粒，我重新跑PCR，有目的片段，说明片段连进去了，质粒没问题。第二，我觉得质粒没有切开，因为之前我提取的质粒，跑电泳，片段也在5000多，我估计和32a的5900差不多，电泳区分不开。第三，我的酶切 ...

提取的质粒PCR用的什么引物？建议用质粒的引物，不要用目的片段的引物，即使用质粒做PCR也有可能出现假阳性。多2000bp，即使是没切开或发生单酶切，出来的条带也会与空载体不同，所以你的这个我觉得还是假阳性。
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4楼2016-08-30 23:59:58
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Yuanfang_818

金虫 (小有名气)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-09-01 08:26:57
引用回帖:
4楼: Originally posted by stone2239 at 2016-08-30 23:59:58
提取的质粒PCR用的什么引物？建议用质粒的引物，不要用目的片段的引物，即使用质粒做PCR也有可能出现假阳性。多2000bp，即使是没切开或发生单酶切，出来的条带也会与空载体不同，所以你的这个我觉得还是假阳性。...

引物用的32a的通用引物T7

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5楼2016-08-31 01:55:31
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cry_2013

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-09-01 08:27:05
我觉有可能是空载体，建议PCR产物测序，如果确实是目的基因，可能就是没切开
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6楼2016-09-01 08:17:12
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y383514131

银虫 (小有名气)
换成20ul体系，1ul酶，质粒1NG，4小时，注意混匀

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此事说来终觉浅，莫问出处便是真
7楼2016-09-01 13:35:23
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y383514131

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
7楼: Originally posted by y383514131 at 2016-09-01 13:35:23
换成20ul体系，1ul酶，质粒1NG，4小时，注意混匀

质粒的量你自己定，我想写的应该是1ug，不过我每次都没用那么多。

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此事说来终觉浅，莫问出处便是真
8楼2016-09-01 13:37:34
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