应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸杂交 » 求助，双酶切
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
51/1返回列表
查看: 1219  |  回复: 7
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

Yuanfang_818

金虫 (小有名气)

[求助] 求助，双酶切 已有4人参与

各位道友，我将2000bp的片段插入到pET-32a中，然后双酶切，电泳只有4000和7000之间，有一条带，估计是32a的5900大小，没有2000的目的条带。怎么回事？我验证过质粒，电泳在5000多，准备跑PCR再验证一下。问题只有质粒吗，还有没有别的原因啊。求教！

发自小木虫Android客户端
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2016-08-30 13:04:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Yuanfang_818

金虫 (小有名气)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-09-01 08:26:42
引用回帖:
2楼: Originally posted by xuegyx at 2016-08-30 16:03:13
可能的原因有：1，目的基因根本没有插入到质粒中；2，双酶切用的酶是只有一种有活性或只有一种酶的酶切位点还有保留；3，酶切用的质粒量太少，目的片段量太少而检测不到

第一，提取的质粒，我重新跑PCR，有目的片段，说明片段连进去了，质粒没问题。第二，我觉得质粒没有切开，因为之前我提取的质粒，跑电泳，片段也在5000多，我估计和32a的5900差不多，电泳区分不开。第三，我的酶切体系是50微升的，两种酶各加了1和2微升，质粒共加了1500ng，酶切了5个小时。

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
3楼2016-08-30 21:14:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 8 个回答

xuegyx

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Yuanfang_818: 金币+3, ★★★很有帮助 2016-08-31 23:10:59
xn8008: 金币+1, 应助指数+1, 欢迎发帖交流 2016-09-01 08:26:09
可能的原因有：1，目的基因根本没有插入到质粒中；2，双酶切用的酶是只有一种有活性或只有一种酶的酶切位点还有保留；3，酶切用的质粒量太少，目的片段量太少而检测不到
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2016-08-30 16:03:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Yuanfang_818: 金币+3, ★★★很有帮助 2016-08-31 23:11:19
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-09-01 08:26:50
引用回帖:
3楼: Originally posted by Yuanfang_818 at 2016-08-30 21:14:13
第一，提取的质粒，我重新跑PCR，有目的片段，说明片段连进去了，质粒没问题。第二，我觉得质粒没有切开，因为之前我提取的质粒，跑电泳，片段也在5000多，我估计和32a的5900差不多，电泳区分不开。第三，我的酶切 ...

提取的质粒PCR用的什么引物？建议用质粒的引物，不要用目的片段的引物，即使用质粒做PCR也有可能出现假阳性。多2000bp，即使是没切开或发生单酶切，出来的条带也会与空载体不同，所以你的这个我觉得还是假阳性。
赞一下 回复此楼
4楼2016-08-30 23:59:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Yuanfang_818

金虫 (小有名气)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-09-01 08:26:57
引用回帖:
4楼: Originally posted by stone2239 at 2016-08-30 23:59:58
提取的质粒PCR用的什么引物？建议用质粒的引物，不要用目的片段的引物，即使用质粒做PCR也有可能出现假阳性。多2000bp，即使是没切开或发生单酶切，出来的条带也会与空载体不同，所以你的这个我觉得还是假阳性。...

引物用的32a的通用引物T7

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
5楼2016-08-31 01:55:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 8 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 310求调剂 +7 争取九点睡 2026-03-30 7/350 2026-03-30 10:56 by 晴空210210
[考研] 材料与化工304求B区调剂 +4 邱gl 2026-03-26 7/350 2026-03-30 08:39 by 探123
[考研] 085600，材料与化工321分求调剂 +10 大馋小子 2026-03-28 10/500 2026-03-29 23:35 by 飞行日记西
[考研] 291求调剂 +7 Y-cap 2026-03-29 8/400 2026-03-29 19:53 by klasasda
[考研] 329求调剂，一志愿西北工业大学，材料工程（085601） +4 小小机灵虫 2026-03-29 10/500 2026-03-29 18:20 by 无际的草原
[考研] 327求调剂 +6 汲亦昊 2026-03-29 6/300 2026-03-29 13:40 by peike
[考研] 调剂考研 +3 王杰一 2026-03-29 3/150 2026-03-29 08:09 by fmesaito
[考研] 321求调剂 +7 璞玉~~ 2026-03-25 8/400 2026-03-29 06:41 by 544594351
[考研] 332求调剂 +4 @MZB382400 2026-03-28 4/200 2026-03-28 21:02 by 唐沐儿
[考研] 一志愿北化085600材料专硕275|有文章专利｜求调剂 +7 Micky11223 2026-03-25 7/350 2026-03-28 18:34 by 无际的草原
[考研] 一志愿华北电力大学能动专硕，293，求调剂 +3 15537177284 2026-03-23 5/250 2026-03-28 16:11 by xxxsssccc
[考研] 070300化学求调剂 +4 起个名咋这么难 2026-03-27 4/200 2026-03-27 21:39 by 83503孙老师
[考研] 266求调剂 +11 阳阳哇塞 2026-03-27 12/600 2026-03-27 17:56 by yu221
[考研] 化学调剂 +4 爱吃番茄的旭 2026-03-24 5/250 2026-03-27 17:50 by kiokin
[考研] 材料292调剂 +12 橘颂思美人 2026-03-23 12/600 2026-03-27 15:44 by caszguilin
[考研] 336材料求调剂 +7 陈滢莹 2026-03-26 9/450 2026-03-27 00:20 by wxiongid
[考研] 材料调剂 5+4 想要一壶桃花水 2026-03-25 10/500 2026-03-26 19:56 by 不吃魚的貓
[考研] 求b区院校调剂 +4 周56 2026-03-24 5/250 2026-03-25 17:12 by yishunmin
[考研] 求调剂 +3 李李不服输 2026-03-25 3/150 2026-03-25 13:03 by cmz0325
[考研] 085404电子信息284分求调剂 +4 13659058978 2026-03-24 4/200 2026-03-24 12:15 by syl20081243
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭