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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 空载体双酶切，出现两天带
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化蝶为谁舞

新虫 (初入文坛)

[求助] 空载体双酶切，出现两天带

空载体大概是8000bp左右，双酶切后有的出现单条带，有的出现了两天带，不理解，求虫友解惑，对做了同样的双酶切的目的条带进行了T4连接酶连接，转化涂板都是一个菌落都没长，重复了三次。仍然是一个菌落都没长。

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1楼 2016-08-11 09:23:46
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化蝶为谁舞

新虫 (初入文坛)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖提问 2016-08-12 07:12:01
空载体双酶切，出现两天带

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2楼2016-08-11 09:24:57
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化蝶为谁舞

新虫 (初入文坛)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖提问 2016-08-12 07:12:08
空载体双酶切，出现两天带-1

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3楼2016-08-11 09:25:17
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点瓣心音

木虫 (小有名气)
★ ★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-08-11 22:23:50
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-08-12 07:12:18
你首先要确定你的空载体是否正确，空载体酶切胶回收后，需要再次跑电泳确认你是否回收成功，然后再去做T4连接。

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4楼2016-08-11 11:35:03
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化蝶为谁舞

新虫 (初入文坛)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-08-12 07:12:24
引用回帖:
4楼: Originally posted by 点瓣心音 at 2016-08-11 11:35:03
你首先要确定你的空载体是否正确，空载体酶切胶回收后，需要再次跑电泳确认你是否回收成功，然后再去做T4连接。

空载体是正确的，胶回收后跑电泳浓度很低，几乎看不到条带。几次都这样

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5楼2016-08-11 13:04:45
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swgcpy

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-08-11 22:24:17
xn8008: 应助指数+1 2016-08-12 07:12:30
双酶切两个位点之间距离有多少个bp呢，8kb的载体把两个位点除去之后有多大
500bp以下的条带还有可能是RNA等，提质粒的时候有可能会出现
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6楼2016-08-11 20:21:57
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化蝶为谁舞

新虫 (初入文坛)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-08-12 07:12:37
引用回帖:
6楼: Originally posted by swgcpy at 2016-08-11 20:21:57
双酶切两个位点之间距离有多少个bp呢，8kb的载体把两个位点除去之后有多大
500bp以下的条带还有可能是RNA等，提质粒的时候有可能会出现

两个酶切位点之间只有几十个bp,但是切后有八千和一个两千多的就比较奇怪了

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7楼2016-08-11 23:33:21
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点瓣心音

木虫 (小有名气)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-08-12 07:12:44
那你多做几个样品来酶切，最终回收到一个EP管里面，酶切后的空载体浓度最高在15ng/ul以上，最后做连接是才容易连上。

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8楼2016-08-12 01:55:00
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点瓣心音

木虫 (小有名气)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-08-12 07:12:51
酶切载体最好过夜酶切，如果切得不彻底，会导自载体自连。通常酶切载体是20微升体系中酶切1ug的载体质粒，做4-6个重复，酶切后用50微升的大孔点样回收，且最好加公司赠送的10Xloading buffer，在跑电泳时有利于DNA的沉降，自己配的6Xloading bufferwe 可以，但效果没有那么好。

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9楼2016-08-12 02:02:45
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化蝶为谁舞

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 点瓣心音 at 2016-08-12 02:02:45
酶切载体最好过夜酶切，如果切得不彻底，会导自载体自连。通常酶切载体是20微升体系中酶切1ug的载体质粒，做4-6个重复，酶切后用50微升的大孔点样回收，且最好加公司赠送的10Xloading buffer，在跑电泳时有利于DNA的 ...

谢谢，换了loading buffer后条带很亮，已经解决了

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10楼2016-08-12 23:17:09
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