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zhangxf2014新虫 (小有名气)
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定量PCR 已有3人参与
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| 刚开始做定量PCR，用的SYBR染料法，阴性对照（只加水）总是有扩增，Ct值都在35以下。之后换实验室、换水、换枪，引物重新合成，试剂也是新开的，但是还是存在阴性扩增，电泳检测，NTC条带和目的基因的一致。现在用UDG试剂做的，问题仍然无法解决，实在想不通是什么原因？实验室有个老师半个月就把定量做完了，我这都做了2个月了。求大神赐教啊！！！ |
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【答案】应助回帖
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污染可能存在以下几个方面： 1、以前有人做过你所扩增的片段的扩增，导致整个环境中到处都是。 2、扩增的时候自己没有注意好，导致环境、试剂、枪头等污染了目的扩增片段。 即使用了UDG，因为如果不是最开始就用这个的话，是无法防止污染的。因为UDG的原理导致它不能解决使用前所发生的污染，只能解决它自身体系的污染。 实验室污染解决的办法：如果是整个大环境污染，每天晚上用5%的84消毒液雾化消毒，超净台、离心机转子等关键仪器用10%84消毒液全部擦拭，第二天早晨再用清水擦洗环境，大约经过一个星期后，应该可以让ct值降到37、38甚至没有，提dna和提rna都别开超净台风机（不开风机提取核酸完全没问题的，而且如果污染，超净台上面的那层滤网上面估计富集了很多目的片段）、枪头用带滤芯的枪头，EP管直接用商家处理好的。等等。 解决污染是一个非常痛苦的过程，因为整个环境中都是84消毒液的味道是很难闻的一件事。我的实验室每天都在坚持，但是还是经常阴性对照的ct值在35之后起来。 其实最好的方法是找一个没有做过你的基因相关的实验室，用全新的试剂来做这个实验，并且刚开始就使用UDG防污染体系。 |
7楼2016-08-08 10:24:43
zhangxf2014
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10楼2016-08-08 12:19:36