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lanmengyixin

新虫 (初入文坛)

[求助] 定量PCR 已有7人参与

各位大神，我最近刚开始做定量PCR，结果没有CT值，也没有成峰，如下图，这是什么原因？求解答

定量PCR
Melt Curve Plot0805.jpg
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1楼 2016-08-06 19:16:19
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lanmengyixin

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
11楼: Originally posted by prthefu at 2016-08-07 22:54:57
我最近也在做。我觉得开始的时候，你可以直接上机做预实验，确定体系的加量和退火温度。然后每次做完看溶解曲线如何。还有，前体是你要确保引物没有问题，模板反转录也是正确的，最后给的建议是，多做几次，自己在每 ...

谢谢！我们实验室做定量PCR都是固定体系，退火温度也是仪器的固定设置，从来没有改过。我再多做几次试试吧！

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18楼2016-08-08 12:14:24
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曼陀罗的祈祷

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我是直接设计好几对引物，然后拿去做普通pcr，然后看跟actin引物扩增亮度最接近的，就选了那一对
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想做个有趣的人，却在逗比的道路上越走越远~
25楼2016-08-09 12:59:43
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普通回帖

取个什么名啊

木虫 (正式写手)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-08-07 08:25:22
你用的是什么仪器
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2楼2016-08-06 20:01:11
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lanmengyixin

新虫 (初入文坛)
xn8008: 欢迎发帖交流 2016-08-07 08:25:27
引用回帖:
2楼: Originally posted by 取个什么名啊 at 2016-08-06 20:01:11
你用的是什么仪器

ABI的仪器

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3楼2016-08-06 20:41:10
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取个什么名啊

木虫 (正式写手)
你上机前做预实验了吗

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4楼2016-08-07 08:27:59
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hanxiaominhu

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
先用普通的PCR检测一下看看能不能P出条带。
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5楼2016-08-07 08:32:00
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wjf7862203

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-08-07 22:12:07
这是溶解曲线图，你用的探针法还是染料法，染料法时候采用溶解曲线，判定扩增特异性。你这张图上看，是没有检测到目标基因。需要分析的原因很多，首先引物设计对不对，模板有没有提取来，试剂是否失效等很多问题
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6楼2016-08-07 14:36:15
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lanmengyixin

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by wjf7862203 at 2016-08-07 14:36:15
这是溶解曲线图，你用的探针法还是染料法，染料法时候采用溶解曲线，判定扩增特异性。你这张图上看，是没有检测到目标基因。需要分析的原因很多，首先引物设计对不对，模板有没有提取来，试剂是否失效等很多问题

用的是SYBR MIX。引物比对了，没有问题。同样的模板也做其他引物了，溶解曲线都是单峰，所以不知道这是什么原因！难道是本身就不表达这个基因？

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7楼2016-08-07 21:01:01
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lanmengyixin

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by hanxiaominhu at 2016-08-07 08:32:00
先用普通的PCR检测一下看看能不能P出条带。

定量的引物可以做普通PCR吗？

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8楼2016-08-07 21:03:06
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lanmengyixin

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 取个什么名啊 at 2016-08-07 08:27:59
你上机前做预实验了吗

没有做预实验，因为之前的文献有过报道，说是会调控这个基因！

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9楼2016-08-07 21:04:12
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hanxiaominhu

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by lanmengyixin at 2016-08-07 21:03:06
定量的引物可以做普通PCR吗？
...

可以的。

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10楼2016-08-07 21:58:01
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