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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 载体构建
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houfuyuan

新虫 (小有名气)

[求助] 载体构建 已有3人参与

载体做PCR有目的条带，但是双酶切后的条带大小不同。
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玉无瑕，青春无华。
1楼 2016-07-23 21:17:27
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pangadmire

铁虫 (小有名气)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-07-24 07:36:43
考虑目的基因是不是存在同样的酶切位点，同时也切断了目的基因

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2楼2016-07-24 00:46:29
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原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
双酶切的条带和pcr差多少呢？有没有图呢？

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天空才是极限，我有信心飞的更高！
3楼2016-07-24 10:35:05
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houfuyuan

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by pangadmire at 2016-07-24 00:46:29
考虑目的基因是不是存在同样的酶切位点，同时也切断了目的基因

设计引物时查了，目的片段里没有酶切位点
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玉无瑕，青春无华。
4楼2016-07-24 13:03:53
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houfuyuan

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-07-24 10:35:05
双酶切的条带和pcr差多少呢？有没有图呢？

目的片段是500左右，载体总的是5.2k.单酶切大小正确的，双酶切后一条4k，一条约大于1k（应该就是1.2k），加起来刚好5.2k。but 没有目的基因片段500。pcr却有500bp的带。何解何解？  原质粒单双酶切都没有问题。
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玉无瑕，青春无华。
5楼2016-07-24 13:08:48
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不爱做实验

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
一般情况下，电泳后，500bp的条带几乎不易看得到：
1、假设500bp条带被成功切下来，但是电泳后并未观察到。
    那么，也就是实际你切出了4k、1k、500bp带。
    说明载体上存在和目的片段两端相同的酶切位点。
2、假设确实没有切出500bp条带，
    那么，是否目的片段两端其中之一的酶切位点已消失。
    这种情况也同时说明，载体上和目的片段两端相同的酶切位点。
个人看法，还需要仔细查看载体及目的片段信息
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6楼2016-07-24 15:04:08
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houfuyuan

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 不爱做实验 at 2016-07-24 15:04:08
一般情况下，电泳后，500bp的条带几乎不易看得到：
1、假设500bp条带被成功切下来，但是电泳后并未观察到。
    那么，也就是实际你切出了4k、1k、500bp带。
    说明载体上存在和目的片段两端相同的酶切位点。
...

嗯 ，是的。在整个重组载体上我选择了三个酶，单切、两两双切、三切结果都显示确实插入了一个500的片段，只是目的基因两端的双酶切时只能看到4.7k，看不到500bp条带。我想再测序一下就更好了。是这样吧应该？
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玉无瑕，青春无华。
7楼2016-07-24 18:31:55
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不爱做实验

银虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by houfuyuan at 2016-07-24 18:31:55
嗯 ，是的。在整个重组载体上我选择了三个酶，单切、两两双切、三切结果都显示确实插入了一个500的片段，只是目的基因两端的双酶切时只能看到4.7k，看不到500bp条带。我想再测序一下就更好了。是这样吧应该？...

其实一般只要菌液PCR鉴定到阳性克隆即可测序。
一般酶切鉴定，在目的片段里和载体上各选一个酶切位点，切出来两带即可，并且不要切的片段太小，不方便看。
那么按照你说的双酶切只有4.7k，那加上500bp不就是正好完整大小？！
说明是没问题，只是500bp条带太弱，不明显。
可以尝试加大酶切量，同时酶切时间一般2-3h即可，过久会切散。
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8楼2016-07-24 19:31:27
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阿尔卑斯英

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
加大质粒酶切量，全部进行电泳，测序最好的方法，PCR很容易出现假阳性。
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9楼2016-07-26 15:16:45
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