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houfuyuan

新虫 (小有名气)

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专业: 生物大分子结构与功能

[求助] 载体构建已有3人参与

载体做PCR有目的条带，但是双酶切后的条带大小不同。

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玉无瑕，青春无华。

1楼 2016-07-23 21:17:27

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不爱做实验

银虫 (正式写手)

应助: 37 (小学生)
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红花: 5
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在线: 68.5小时
虫号: 3124215
注册: 2014-04-09
性别: GG
专业: 生物信息学

引用回帖:

7楼: Originally posted by houfuyuan at 2016-07-24 18:31:55
嗯，是的。在整个重组载体上我选择了三个酶，单切、两两双切、三切结果都显示确实插入了一个500的片段，只是目的基因两端的双酶切时只能看到4.7k，看不到500bp条带。我想再测序一下就更好了。是这样吧应该？...

其实一般只要菌液PCR鉴定到阳性克隆即可测序。
一般酶切鉴定，在目的片段里和载体上各选一个酶切位点，切出来两带即可，并且不要切的片段太小，不方便看。
那么按照你说的双酶切只有4.7k，那加上500bp不就是正好完整大小？！
说明是没问题，只是500bp条带太弱，不明显。
可以尝试加大酶切量，同时酶切时间一般2-3h即可，过久会切散。