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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 载体构建
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18354255512

新虫 (小有名气)

[求助] 载体构建 已有5人参与

构建载体过程中，将我的目的片段大约1000bp连接到pcambia1302载体上，挑的克隆做菌落pcr带很亮，但测序一直无信号，已经做了一个多月了，重新连接转化了好几次了，都是无信号，是怎么回事啊？求大神指点

@biostar2009 发自小木虫Android客户端
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1楼 2016-07-21 09:36:43
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

王平阳

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-07-21 12:59:47
不知道你测序是自己做的还是公司做的，测序引物是什么？
测序没有信号一般就两个原因，一是测序引物在质粒上没有匹配序列，即质粒构建错误或者测序引物不对，既然你的菌P没有问题，建议采用你做菌P的引物测序，上下游做一个双向测，如还需要载体上序列，可以采用步移法测序；另一个可能的原因就是质粒污染，测序峰非常混乱，从而表现出无信号，你既然做了很多次，这个应该可以排除。祝你好运！
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没有做不到，只有想不到！
2楼2016-07-21 09:56:16
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781055707

木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 18354255512 at 2016-07-21 11:19:06
双酶切没有做，不过假阳性率会那么高吗，每次菌pcr的带都挺亮的呀
...

那你要双酶切得呀，PCR对于有些片段是很容易产生气溶胶污染的。
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采菊东篱下，悠然见南山。
6楼2016-07-21 16:48:29
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普通回帖

781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-07-21 12:59:54
你双酶切过吗，PCR假阳性也说不定的。
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采菊东篱下，悠然见南山。
3楼2016-07-21 11:01:12
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18354255512

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 王平阳 at 2016-07-21 09:56:16
不知道你测序是自己做的还是公司做的，测序引物是什么？
测序没有信号一般就两个原因，一是测序引物在质粒上没有匹配序列，即质粒构建错误或者测序引物不对，既然你的菌P没有问题，建议采用你做菌P的引物测序，上下 ...

非常感谢你的提议，我是送公司做的，你所说的质粒污染是我测序送的质粒吗，还是构建过程中目的片段和载体的污染啊，不过我之前大多送的是菌液，就送过两次质粒，都测出来没信号

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4楼2016-07-21 11:17:24
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18354255512

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 781055707 at 2016-07-21 11:01:12
你双酶切过吗，PCR假阳性也说不定的。

双酶切没有做，不过假阳性率会那么高吗，每次菌pcr的带都挺亮的呀

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5楼2016-07-21 11:19:06
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你是怎么连的呀，双酶切、单酶切还是怎样，会不会出现双向的连接产物啊，这样的话可能没有信号
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···
7楼2016-07-22 11:01:46
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feierorange

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的质粒没有酶切鉴定一下吗？菌落PCR的结果不一定可信
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8楼2016-07-22 13:02:09
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18354255512

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 小冀- at 2016-07-22 11:01:46
你是怎么连的呀，双酶切、单酶切还是怎样，会不会出现双向的连接产物啊，这样的话可能没有信号

双酶切的

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9楼2016-07-22 19:48:32
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风萧萧1028

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
肯定要提取质粒做双酶切验证啊！
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10楼2016-07-22 21:30:43
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