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lx910615

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[求助] western blot 求助，荧光猝灭的很快，请各位指点一二。已有3人参与

求助，破碎菌体得胞内蛋白，做western,1抗（自制）1：2000 摇床1h，4℃过夜，TBST洗膜6次/10min, 二抗1：5000 1.5h,TBST洗膜3次/10min,TBS洗一次。碧云天ECL发光液1：1，荧光猝灭的很快，请各位指点一二。

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1楼 2016-07-14 14:34:26

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314300420

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猝灭有两种，一种是膜上结合的HRP太多，导致底物快速耗尽，此时膜上会留下黄褐色条带的印迹，另一种是有ECL液体时在发光，吸掉后很快荧光消失，这种情况是有污染物存在，别问我具体是什么污染，我也不清楚

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lx910615

2楼2016-07-14 17:45:55

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ericyo918

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【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1

楼上正解，再加上ECL结合时间过长，显影时间过长。总之先减少一抗量吧。

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3楼2016-07-15 14:28:13

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lx910615

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引用回帖:

2楼: Originally posted by 314300420 at 2016-07-14 17:45:55
猝灭有两种，一种是膜上结合的HRP太多，导致底物快速耗尽，此时膜上会留下黄褐色条带的印迹，另一种是有ECL液体时在发光，吸掉后很快荧光消失，这种情况是有污染物存在，别问我具体是什么污染，我也不清楚
...

谢谢

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4楼2016-07-16 12:40:04

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