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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » western blot 求助，荧光猝灭的很快，请各位指点一二。
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lx910615

新虫 (小有名气)

[求助] western blot 求助，荧光猝灭的很快，请各位指点一二。 已有3人参与

求助，破碎菌体得胞内蛋白，做western,1抗（自制）1：2000 摇床1h，4℃过夜，TBST洗膜6次/10min, 二抗1：5000 1.5h,TBST洗膜3次/10min,TBS洗一次。碧云天ECL发光液1：1，荧光猝灭的很快，请各位指点一二。
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1楼 2016-07-14 14:34:26
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314300420

捐助贵宾 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 曼陀罗的祈祷 at 2016-07-16 13:55:25
我用的是NBT/BCIP避光显色，今天显色的时候显色6分钟，有的蛋白印迹颜色很浅，有的很深，那种颜色浅的算不算有反应...

当然算了，不同样本蛋白表达有差异，这是好现象

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7楼2016-07-16 14:23:45
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314300420

捐助贵宾 (著名写手)
猝灭有两种，一种是膜上结合的HRP太多，导致底物快速耗尽，此时膜上会留下黄褐色条带的印迹，另一种是有ECL液体时在发光，吸掉后很快荧光消失，这种情况是有污染物存在，别问我具体是什么污染，我也不清楚

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lx910615 lx910615
2楼2016-07-14 17:45:55
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ericyo918

至尊木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
楼上正解，再加上ECL结合时间过长，显影时间过长。总之先减少一抗量吧。
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3楼2016-07-15 14:28:13
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lx910615

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by 314300420 at 2016-07-14 17:45:55
猝灭有两种，一种是膜上结合的HRP太多，导致底物快速耗尽，此时膜上会留下黄褐色条带的印迹，另一种是有ECL液体时在发光，吸掉后很快荧光消失，这种情况是有污染物存在，别问我具体是什么污染，我也不清楚
...

谢谢

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4楼2016-07-16 12:40:04
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