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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 质粒提取
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yml11

新虫 (初入文坛)

[交流] 质粒提取 已有6人参与

各位大神们，小妹请教一个问题。我从DH5a中提重组质粒pET-32a-目的片段，一直都提不出来呀，用的是天根的小质粒提取试剂盒来做的。请问是什么原因，该怎么办呢？

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1楼 2016-07-01 12:42:37
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安静de执着14

新虫 (著名写手)
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xn8008: 金币+1, 应助指数+1, 欢迎发帖交流 2016-07-02 07:06:59
你的试剂盒有没有问题啊？可以做个对照，换种质粒提一下。还有就是，你的DH5α确定含有质粒吗？会不会是假阳性？再者就是你确定你操作没问题吗？很多小细节都会影响提取效率。还有就是你怎么确定你的质粒没有提取出来的？是测浓度还是跑胶验证？

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2楼2016-07-01 19:48:46
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MMCCBB

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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-07-03 22:29:43
重组质粒第一步需要鉴定出正确克隆，然后过夜培养提质粒，你提质粒的菌液OD值应该为2——4。另外你现在选的感受态转化效率没有全是金的T1转化效率高，不行可以换它

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3楼2016-07-02 07:44:38
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yml11

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 安静de执着14 at 2016-07-01 19:48:46
你的试剂盒有没有问题啊？可以做个对照，换种质粒提一下。还有就是，你的DH5α确定含有质粒吗？会不会是假阳性？再者就是你确定你操作没问题吗？很多小细节都会影响提取效率。还有就是你怎么确定你的质粒没有提取出 ...

试剂盒应该没问题，之前提原始的质粒都能提出来的。现在就是在想是不是假阳性呢，送公司测序也说测不出来

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4楼2016-07-02 17:30:35
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yml11

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by MMCCBB at 2016-07-02 07:44:38
重组质粒第一步需要鉴定出正确克隆，然后过夜培养提质粒，你提质粒的菌液OD值应该为2——4。另外你现在选的感受态转化效率没有全是金的T1转化效率高，不行可以换它

因为我的片段只有110bp，所以选个低拷贝的质粒来做的。

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5楼2016-07-02 17:31:30
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MMCCBB

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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
这样需要测序，确定目的条带是正确的

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6楼2016-07-02 18:07:24
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MMCCBB

新虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by yml11 at 2016-07-02 17:31:30
因为我的片段只有110bp，所以选个低拷贝的质粒来做的。
...

测序确认你的目的条带OK

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7楼2016-07-02 18:08:12
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MMCCBB

新虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by MMCCBB at 2016-07-02 18:07:24
这样需要测序，确定目的条带是正确的

北京有很多测序公司，第一天送样，第二天可以出结果，然后你与标准序列比对

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8楼2016-07-02 18:09:17
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yml11

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by MMCCBB at 2016-07-02 18:07:24
这样需要测序，确定目的条带是正确的

送公司测序了，但是说的是模版浓度太低，测不出来

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9楼2016-07-03 22:05:21
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匿名

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10楼2016-07-04 13:36:44
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