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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » RT-pcr的一些问题。。
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kshdd

金虫 (著名写手)

[交流] RT-pcr的一些问题。。 已有2人参与

各位大神，环境水样滤膜提RNA，浓度在40-60ng/ul，总量100ul，取5ul进行反转录，得20ul体系，反转录后对特定功能基因用qPCRmix进行PCR，40循环，跑胶发现条带很暗。请问实验方案有问题没，怎么进一步优化实验方案？
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1楼 2016-06-19 11:18:43
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kshdd

金虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xn8008 at 2016-06-19 12:55:27
1.你的环境水是超纯水还是蒸馏水？不会是自来水吧，最好用含有RNase Inhinitor的纯水，避免讲解；
2.你的条带暗，可能与你的温度不是最佳温度有关；
3.换用单独的rTaq吧，我对现在那些什么都混在一起的试剂盒不太 ...

1、水样为养殖海水，0.22um滤膜过滤，
2、退火温度是以DNA做模板摸索的，
3、试剂盒用的是trans的one-step gDNA removal and cDNA synthesis supermix
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3楼2016-06-19 13:09:53
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xn8008

至尊木虫 (知名作家)

Balance Angel
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2016-06-19 13:37:43
1.你的环境水是超纯水还是蒸馏水？不会是自来水吧，最好用含有RNase Inhinitor的纯水，避免讲解；
2.你的条带暗，可能与你的温度不是最佳温度有关；
3.换用单独的rTaq吧，我对现在那些什么都混在一起的试剂盒不太放心，而且你没说你的试剂盒怎么保存，你的酶如何保存，这些都很重要
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奋斗是我们前进的动力！
2楼2016-06-19 12:55:27
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xn8008

至尊木虫 (知名作家)

Balance Angel
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by kshdd at 2016-06-19 13:09:53
1、水样为养殖海水，0.22um滤膜过滤，
2、退火温度是以DNA做模板摸索的，
3、试剂盒用的是trans的one-step gDNA removal and cDNA synthesis supermix...

1.除了超纯水和含有RNase Inhibitor的纯水以外，其他各种水都可能含有RNA酶，所以请你更换水；
2.你现在出现电泳条带了，但还需要继续摸索，提高亮度，就是提高你的PCR目的条带的产量；
3.采用两步法的PCR吧，很多时候一步法混在一起的酶不好，还有，你的酶怎么储存的，什么温度，是不是避光，其他什么条件
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奋斗是我们前进的动力！
4楼2016-06-19 16:58:20
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kshdd

金虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by xn8008 at 2016-06-19 16:58:20
1.除了超纯水和含有RNase Inhibitor的纯水以外，其他各种水都可能含有RNA酶，所以请你更换水；
2.你现在出现电泳条带了，但还需要继续摸索，提高亮度，就是提高你的PCR目的条带的产量；
3.采用两步法的PCR吧，很 ...

1、你可能理解错了，我的样品就是水样，只不过是用滤膜过滤后保存在RNA保存液中；
2、我现在觉得条带暗的原因可能是反转录后，目的基因拷贝数低；
3、pcr体系的mix，takara针对qPC的mix，好的看一下2步法流程
4、谢谢
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5楼2016-06-20 22:08:07
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