应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » RT-pcr的一些问题。。
51/1返回列表
查看: 1052  |  回复: 7
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

kshdd

金虫 (著名写手)

[交流] RT-pcr的一些问题。。 已有2人参与

各位大神，环境水样滤膜提RNA，浓度在40-60ng/ul，总量100ul，取5ul进行反转录，得20ul体系，反转录后对特定功能基因用qPCRmix进行PCR，40循环，跑胶发现条带很暗。请问实验方案有问题没，怎么进一步优化实验方案？
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2016-06-19 11:18:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kshdd

金虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xn8008 at 2016-06-19 12:55:27
1.你的环境水是超纯水还是蒸馏水？不会是自来水吧，最好用含有RNase Inhinitor的纯水，避免讲解；
2.你的条带暗，可能与你的温度不是最佳温度有关；
3.换用单独的rTaq吧，我对现在那些什么都混在一起的试剂盒不太 ...

1、水样为养殖海水，0.22um滤膜过滤，
2、退火温度是以DNA做模板摸索的，
3、试剂盒用的是trans的one-step gDNA removal and cDNA synthesis supermix
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2016-06-19 13:09:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 8 个回答

xn8008

至尊木虫 (知名作家)

Balance Angel
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2016-06-19 13:37:43
1.你的环境水是超纯水还是蒸馏水？不会是自来水吧，最好用含有RNase Inhinitor的纯水，避免讲解；
2.你的条带暗，可能与你的温度不是最佳温度有关；
3.换用单独的rTaq吧，我对现在那些什么都混在一起的试剂盒不太放心，而且你没说你的试剂盒怎么保存，你的酶如何保存，这些都很重要
赞一下 回复此楼
奋斗是我们前进的动力！
2楼2016-06-19 12:55:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xn8008

至尊木虫 (知名作家)

Balance Angel
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by kshdd at 2016-06-19 13:09:53
1、水样为养殖海水，0.22um滤膜过滤，
2、退火温度是以DNA做模板摸索的，
3、试剂盒用的是trans的one-step gDNA removal and cDNA synthesis supermix...

1.除了超纯水和含有RNase Inhibitor的纯水以外，其他各种水都可能含有RNA酶，所以请你更换水；
2.你现在出现电泳条带了，但还需要继续摸索，提高亮度，就是提高你的PCR目的条带的产量；
3.采用两步法的PCR吧，很多时候一步法混在一起的酶不好，还有，你的酶怎么储存的，什么温度，是不是避光，其他什么条件
赞一下 回复此楼
奋斗是我们前进的动力！
4楼2016-06-19 16:58:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kshdd

金虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by xn8008 at 2016-06-19 16:58:20
1.除了超纯水和含有RNase Inhibitor的纯水以外，其他各种水都可能含有RNA酶，所以请你更换水；
2.你现在出现电泳条带了，但还需要继续摸索，提高亮度，就是提高你的PCR目的条带的产量；
3.采用两步法的PCR吧，很 ...

1、你可能理解错了，我的样品就是水样，只不过是用滤膜过滤后保存在RNA保存液中；
2、我现在觉得条带暗的原因可能是反转录后，目的基因拷贝数低；
3、pcr体系的mix，takara针对qPC的mix，好的看一下2步法流程
4、谢谢
赞一下 回复此楼
5楼2016-06-20 22:08:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 8 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 294分080500材料科学与工程求调剂 +4 柳溪边 2026-03-26 4/200 2026-03-26 21:14 by XPU李庆
[考研] 329求调剂 +4 钮恩雪 2026-03-25 4/200 2026-03-26 20:53 by sanrepian
[考研] 【双一流院校新能源、环境材料，材料加工与模拟招收大量调剂】 +4 Higraduate 2026-03-22 8/400 2026-03-26 20:34 by Higraduate
[考研] 085701环境工程，267求调剂 +4 minht 2026-03-26 4/200 2026-03-26 20:14 by barlinike
[考研] 22 350 本科985求调剂，求老登收留 +4 李轶男003 2026-03-20 4/200 2026-03-26 16:05 by 哇啦啦啦xtj
[考研] 315分求调剂 +5 26考研上岸版26 2026-03-26 5/250 2026-03-26 12:11 by laoshidan
[考研] 302求调剂 +4 锦衣卫藤椒 2026-03-25 4/200 2026-03-25 16:29 by 功夫疯狂
[考研] 一志愿吉林大学材料与化工303分求调剂 +4 为学666 2026-03-24 4/200 2026-03-25 11:27 by BruceLiu320
[考研] 289材料与化工（085600）B区求调剂 +4 这么名字咋样 2026-03-22 5/250 2026-03-25 08:20 by mx.yue
[考研] 070300化学求调剂 +9 苑豆豆 2026-03-20 9/450 2026-03-24 17:15 by licg0208
[考研] 300求调剂，材料科学英一数二 +5 leaflight 2026-03-24 5/250 2026-03-24 16:25 by laoshidan
[考研] 材料专硕331求调剂 +4 鲜当牛 2026-03-24 4/200 2026-03-24 15:58 by JourneyLucky
[考研] 344求调剂 +3 desto 2026-03-24 3/150 2026-03-24 10:09 by 搏击518
[考研] 工科0856求调剂 +5 沐析汀汀 2026-03-21 5/250 2026-03-23 17:56 by 海瑟薇-
[考研] 293求调剂 +3 涛涛Wjt 2026-03-22 5/250 2026-03-22 22:21 by jiangpengfei
[考研] 324求调剂 +6 lucky呀呀呀鸭 2026-03-20 6/300 2026-03-22 16:01 by ColorlessPI
[考研] 求调剂院校信息 +6 CX 330 2026-03-21 6/300 2026-03-22 15:25 by 无懈可击111
[考研] 求助 +5 梦里的无言 2026-03-21 6/300 2026-03-21 17:51 by 学员8dgXkO
[考研] 材料 271求调剂 +5 展信悦_ 2026-03-21 5/250 2026-03-21 17:29 by 学员8dgXkO
[考研] 一志愿重庆大学085700资源与环境总分308求调剂 +7 墨墨漠 2026-03-20 7/350 2026-03-21 16:36 by barlinike
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭