应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » RT-pcr的一些问题。。
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
81/1返回列表
查看: 1063  |  回复: 7
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

kshdd

金虫 (著名写手)

[交流] RT-pcr的一些问题。。 已有2人参与

各位大神，环境水样滤膜提RNA，浓度在40-60ng/ul，总量100ul，取5ul进行反转录，得20ul体系，反转录后对特定功能基因用qPCRmix进行PCR，40循环，跑胶发现条带很暗。请问实验方案有问题没，怎么进一步优化实验方案？
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2016-06-19 11:18:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xn8008

至尊木虫 (知名作家)

Balance Angel
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2016-06-19 13:37:43
1.你的环境水是超纯水还是蒸馏水？不会是自来水吧，最好用含有RNase Inhinitor的纯水，避免讲解；
2.你的条带暗，可能与你的温度不是最佳温度有关；
3.换用单独的rTaq吧，我对现在那些什么都混在一起的试剂盒不太放心，而且你没说你的试剂盒怎么保存，你的酶如何保存，这些都很重要
赞一下 回复此楼
奋斗是我们前进的动力！
2楼2016-06-19 12:55:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kshdd

金虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xn8008 at 2016-06-19 12:55:27
1.你的环境水是超纯水还是蒸馏水？不会是自来水吧，最好用含有RNase Inhinitor的纯水，避免讲解；
2.你的条带暗，可能与你的温度不是最佳温度有关；
3.换用单独的rTaq吧，我对现在那些什么都混在一起的试剂盒不太 ...

1、水样为养殖海水，0.22um滤膜过滤，
2、退火温度是以DNA做模板摸索的，
3、试剂盒用的是trans的one-step gDNA removal and cDNA synthesis supermix
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2016-06-19 13:09:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xn8008

至尊木虫 (知名作家)

Balance Angel
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by kshdd at 2016-06-19 13:09:53
1、水样为养殖海水，0.22um滤膜过滤，
2、退火温度是以DNA做模板摸索的，
3、试剂盒用的是trans的one-step gDNA removal and cDNA synthesis supermix...

1.除了超纯水和含有RNase Inhibitor的纯水以外，其他各种水都可能含有RNA酶，所以请你更换水；
2.你现在出现电泳条带了，但还需要继续摸索，提高亮度，就是提高你的PCR目的条带的产量；
3.采用两步法的PCR吧，很多时候一步法混在一起的酶不好，还有，你的酶怎么储存的，什么温度，是不是避光，其他什么条件
赞一下 回复此楼
奋斗是我们前进的动力！
4楼2016-06-19 16:58:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kshdd

金虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by xn8008 at 2016-06-19 16:58:20
1.除了超纯水和含有RNase Inhibitor的纯水以外，其他各种水都可能含有RNA酶，所以请你更换水；
2.你现在出现电泳条带了，但还需要继续摸索，提高亮度，就是提高你的PCR目的条带的产量；
3.采用两步法的PCR吧，很 ...

1、你可能理解错了，我的样品就是水样，只不过是用滤膜过滤后保存在RNA保存液中；
2、我现在觉得条带暗的原因可能是反转录后，目的基因拷贝数低；
3、pcr体系的mix，takara针对qPC的mix，好的看一下2步法流程
4、谢谢
赞一下 回复此楼
5楼2016-06-20 22:08:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xn8008

至尊木虫 (知名作家)

Balance Angel
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by kshdd at 2016-06-20 22:08:07
1、你可能理解错了，我的样品就是水样，只不过是用滤膜过滤后保存在RNA保存液中；
2、我现在觉得条带暗的原因可能是反转录后，目的基因拷贝数低；
3、pcr体系的mix，takara针对qPC的mix，好的看一下2步法流程
4 ...

如果你可以找到问题也不错，加油

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
奋斗是我们前进的动力！
6楼2016-06-20 22:08:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kshdd

金虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by xn8008 at 2016-06-20 22:08:55
如果你可以找到问题也不错，加油
...

谢谢讨论

发自小木虫Android客户端
回复此楼
7楼2016-06-20 22:53:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

biotech_zhou

木虫 (著名写手)

待人以诚：专业/专注/专心
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
高品质2×逆转录MIX，预混即用型操作快捷方便，RT反应只需加入模板和水，合成的第一链cDNA可广泛用于2nd Strand的合成、杂交、PCR扩增、Real-Time PCR反应等。免费试用申请进行中，有意招呼一声······
赞一下 回复此楼
年末优惠荧光定量pcr、WB、ELISA技术服务一律六折！交流锤炼知识，用心构筑桥梁，以更优质的产品及技术服务助力科研；QQ：2513165427；Email：b
8楼2016-06-22 09:11:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 kshdd 的主题更新
81/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 289求调剂 +9 新时代材料 2026-03-27 9/450 2026-03-28 09:28 by baoball
[材料工程] 一志愿C9材料与化工专业总分300求调剂 +8 曼111 2026-03-24 9/450 2026-03-28 07:58 by YYYYX1234
[考研] 286求调剂 +10 PolarBear11 2026-03-26 10/500 2026-03-28 07:52 by baoball
[考研] 085602 化工专硕 338分 求调剂 +10 路痴小琪 2026-03-27 10/500 2026-03-28 03:36 by fmesaito
[考研] 一志愿哈尔滨工业大学材料与化工方向336分 +6 辰沐5211314 2026-03-26 6/300 2026-03-28 03:31 by fmesaito
[考研] 283求调剂（080500） +4 A child 2026-03-27 4/200 2026-03-27 15:34 by XPU李庆
[考研] 269专硕求调剂 +10 金恩贝 2026-03-21 10/500 2026-03-27 15:10 by caszguilin
[考研] 324求调剂 +5 hanamiko 2026-03-26 5/250 2026-03-27 10:33 by wangjy2002
[考研] 材料学硕，求调剂 6+5 糖葫芦888ll 2026-03-22 10/500 2026-03-27 08:18 by hypershenger
[考研] 284求调剂 +11 junqihahaha 2026-03-26 12/600 2026-03-27 04:37 by wxiongid
[考研] 一志愿北化求调剂 +3 Jsman 2026-03-22 3/150 2026-03-26 21:06 by ajpv风雷
[考研] 325求调剂 +3 Aoyijiang 2026-03-23 3/150 2026-03-26 20:46 by 不吃魚的貓
[考研] 材料调剂 5+4 想要一壶桃花水 2026-03-25 10/500 2026-03-26 19:56 by 不吃魚的貓
[考研] 材料考研求调剂 +3 Dendel 2026-03-23 6/300 2026-03-26 17:51 by fmesaito
[考研] 352求调剂 +4 大米饭！ 2026-03-22 4/200 2026-03-26 16:40 by 不吃魚的貓
[考研] 282求调剂 +3 wcq131415 2026-03-24 3/150 2026-03-25 12:16 by userper
[考研] 上海电力大学材料防护与新材料重点实验室招收调剂研究生（材料、化学、电化学，环境） +4 我爱学电池 2026-03-23 4/200 2026-03-25 00:59 by 1027_324
[考研] 材料专硕331求调剂 +4 鲜当牛 2026-03-24 4/200 2026-03-24 15:58 by JourneyLucky
[考研] 384求调剂 +3 子系博 2026-03-22 6/300 2026-03-23 21:45 by 子系博
[考研] 275求调剂 +6 shansx 2026-03-22 8/400 2026-03-22 15:27 by barlinike
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭