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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR为阳，双酶切鉴定无目的条带！！！！
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csadxm521

禁虫 (小有名气)
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1楼 2016-06-13 15:07:51
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
xn8008: 金币+1, 应助指数+1, 支持积极回帖 2016-06-13 18:37:21
一方面你可以跑一个未酶切的质粒在旁边作为对照，看看你所谓的两条带是不是没有酶切开的质粒。另外可以尝试用特异性引物对提取的质粒进行pcr验证，同时拿pet空载做阴性对照，可以扩增你目的片段的模板作为阳性对照，这样来验证也可，祝好！

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天空才是极限，我有信心飞的更高！
5楼2016-06-13 18:33:42
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小周

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
xn8008: 金币+1, 应助指数+1, 支持积极回帖 2016-06-13 18:37:05
认为你的PCR没问题，就挑两三个直接测序去。别纠结
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2楼2016-06-13 15:17:17
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
xn8008: 金币+1, 应助指数+1, 欢迎积极回应问题 2016-06-18 08:14:28
PCR鉴定为阳性，酶切不出条带。
这个问题出在，PCR是假阳性，如果你的PCR引物用的都是你的目的基因上的话。消除PCR假阳性，引物最好一条是你基因上的，一条在载体上

还有把你PCR的电泳图谱发上来看看，假阳性可以看得出来
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
12楼2016-06-16 02:45:55
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普通回帖

小周

铁杆木虫 (著名写手)
Marker 不一定准。
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3楼2016-06-13 15:18:33
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苏莫离

新虫 (初入文坛)
建议查看载体图谱，确认酶没有用错。另外看看酶的用量或者质粒的用量有没有问题

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4楼2016-06-13 16:01:08
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黄启秀

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
xn8008: 金币+1, 应助指数+1, 欢迎积极回帖，提出有意义的意见 2016-06-18 08:12:50
我也遇到相似问题  现在想尝试扩大提取质粒量  获得质量浓度都比较好的质粒后  先做质粒PCR，再进行酶切～

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6楼2016-06-13 23:36:34
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小彬彬1991

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-06-15 22:53:45
xn8008: 金币+1, 应助指数+1 2016-06-18 08:13:58
建议换两个酶切位点，在载体上再找两个，位于你目的片段的两端，有的时候用你构建时的那两种酶的话，可能酶切鉴定的时候不容易切开。另外酶切时可以多切一段时间，现在的快切酶说的时间挺短的，个人感觉切不完全。

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实验做出来的是结果，做不出来就只是实验。
7楼2016-06-14 11:06:40
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Fiona鳯

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
将10个阳性克隆扩菌后直接送去测序试试看
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8楼2016-06-14 13:18:47
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werq63

金虫 (著名写手)
分析一下整个质粒的序列，最好一个是载体上一个是基因上

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9楼2016-06-15 22:08:14
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werq63

金虫 (著名写手)
或者重新自连一下载体，看看载体会不会自连

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10楼2016-06-15 22:08:56
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