应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 自己的初次蛋白纯化实验
71/1返回列表
查看: 1194  |  回复: 6
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

zy晨曦

新虫 (小有名气)

[交流] 自己的初次蛋白纯化实验 已有2人参与

通过上一次的蛋白纯化，发现酶活的回收率低（目前没有着重考察纯度的问题），所以今天通过降低ph来考察酶活的回收率的问题。通过一天的不间断的实验，发现降低ph能快速洗脱目的蛋白，但是纯化还没有测定。先说说具体的步骤吧。
首先调整了弱阴离子树脂的ph为7.0，还是将树脂倒出然后直接调ph的方法，粗糙而又快速的方法。
调整酶液的ph有点问题，因为利用3M盐酸调整会出现浑浊，主要是因为强酸会导致局部ph过低，酶变性了。所以我利用0.05m的磷酸氢二钾调整ph。成功。
上柱300ml，比上次的柱子上的酶液体积多了100ml，但是酶活略微低于上一个酶液。总体算来，两者的上样量差不多。但是洗脱规律却差了很多
0.2m氯化钠就能洗脱出30%的目的蛋白，0.3m氯化钠在第一个0.5BV时就洗脱出45%的目的蛋白，虽然心里在怀疑这个ph不适合，但是毕竟洗脱出来的酶活高，浓度大，接着0.3M洗脱的第二个0.5BV就没有酶活了，说明洗脱过快。如果可以下次应该改用0.25M洗脱了。接下来的0.4M就没有洗脱出来蛋白。基本在0.3M就洗脱出来了全部的蛋白，但是还是有20%左右的酶活不知道在哪里？酶在和我玩捉迷藏，而树脂一直帮着它，我是孤家寡人了。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
日事日毕，日清日高
1楼 2016-06-06 21:16:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hc-material

专家顾问 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
描述的好有意思。
你用的Q的还是DEAE的。
建议清洗直接用0.1M的氯化钠，洗脱用0.35M的氯化钠。PH就用PH7.0的，洗脱的快了是好事啊。另外缓冲液中加20%甘油，可防止酶失活，另外层析过程尽量在低温4度环境中进行，祝顺利
赞一下(1人) 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

zy晨曦
2楼2016-06-07 10:09:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

璧月

捐助贵宾 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
没弄明白为什么把填料弄出来换ph环境？离子交换两种洗脱方法，盐洗脱和ph洗脱。盐是改变环境电导，ph是改变蛋白带电。直接往柱子里泵缓冲液就可以的，为什么要拆出来呢？

发自小木虫Android客户端
赞一下(1人) 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

zy晨曦
3楼2016-06-09 14:22:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zy晨曦

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by hc-material at 2016-06-07 10:09:46
描述的好有意思。
你用的Q的还是DEAE的。
建议清洗直接用0.1M的氯化钠，洗脱用0.35M的氯化钠。PH就用PH7.0的，洗脱的快了是好事啊。另外缓冲液中加20%甘油，可防止酶失活，另外层析过程尽量在低温4度环境中进 ...

谢谢您的回复，你的建议对我的实验很有帮助，目前我只尝试了7.5和7.0洗脱，还想着再调低pH观察洗脱情况。你觉得有必要再调低ph吗？
赞一下 回复此楼
日事日毕，日清日高
4楼2016-06-11 20:03:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zy晨曦

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by 璧月 at 2016-06-09 14:22:51
没弄明白为什么把填料弄出来换ph环境？离子交换两种洗脱方法，盐洗脱和ph洗脱。盐是改变环境电导，ph是改变蛋白带电。直接往柱子里泵缓冲液就可以的，为什么要拆出来呢？
...

您好！谢谢您的回复，我现在主要是利用盐洗脱，因为现在使用的是弱阴离子交换树脂，缓冲液是7.5的磷酸盐缓冲液，最初是想着利用0.5M的磷酸盐缓冲液直接冲柱子调节ph,我是怕磷酸根离子结合到树脂柱上。
赞一下 回复此楼
日事日毕，日清日高
5楼2016-06-11 20:07:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

璧月

捐助贵宾 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by zy晨曦 at 2016-06-11 20:07:00
您好！谢谢您的回复，我现在主要是利用盐洗脱，因为现在使用的是弱阴离子交换树脂，缓冲液是7.5的磷酸盐缓冲液，最初是想着利用0.5M的磷酸盐缓冲液直接冲柱子调节ph,我是怕磷酸根离子结合到树脂柱上。...

改变pH洗脱需要跨越等电点，过等电点1-2个pH单位，让蛋白带电改变。不洗杂的话就直接选择pH低于等电点的缓冲液冲柱子。
盐洗脱就是要让强离子结合在柱子上，把蛋白换下来。我都用氯化钠，用1M的浓度+平衡缓冲拉个盐梯度，然后就知道该用多大浓度的氯化钠洗脱了。
赞一下 回复此楼
6楼2016-06-12 09:46:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zy晨曦

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 璧月 at 2016-06-12 09:46:06
改变pH洗脱需要跨越等电点，过等电点1-2个pH单位，让蛋白带电改变。不洗杂的话就直接选择pH低于等电点的缓冲液冲柱子。
盐洗脱就是要让强离子结合在柱子上，把蛋白换下来。我都用氯化钠，用1M的浓度+平衡缓冲拉个 ...

我这里的实验条件很简单，只有一个树脂柱，我现在是分段洗脱，发现酶活的回收率总是不高，现在大约在70%左右，目前正在改变上样液和洗脱剂的ph，然后盐洗脱中酶活回收率有所提高。
赞一下 回复此楼
日事日毕，日清日高
7楼2016-06-12 20:14:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 zy晨曦 的主题更新
71/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 274求调剂 +13 顾九笙要谦虚 2026-03-24 19/950 2026-03-26 13:30 by 小小麦片
[考研] 一志愿上海交大生物与医药专硕324分，求调剂 +6 jiajunX 2026-03-22 6/300 2026-03-25 23:05 by licg0208
[考研] 08工学调剂 +13 用户573181 2026-03-20 18/900 2026-03-25 22:00 by zbssa
[考研] 334分 一志愿武理-080500 材料求调剂 +4 李李不服输 2026-03-25 4/200 2026-03-25 21:26 by 星空星月
[考研] 求b区院校调剂 +4 周56 2026-03-24 5/250 2026-03-25 17:12 by yishunmin
[考研] 284求调剂 +15 Zhao anqi 2026-03-22 15/750 2026-03-25 12:51 by wht0531
[考研] 285求调剂 +3 AZMK 2026-03-24 3/150 2026-03-25 12:23 by userper
[考研] 293求调剂 +7 加一一九 2026-03-24 7/350 2026-03-25 12:02 by userper
[考研] 求调剂 +5 林之夕 2026-03-24 5/250 2026-03-24 17:16 by dick_runner
[考研] 300求调剂，材料科学英一数二 +5 leaflight 2026-03-24 5/250 2026-03-24 16:25 by laoshidan
[考研] 一志愿吉大化学322求调剂 +4 17501029541 2026-03-23 6/300 2026-03-24 10:21 by 戴围脖的小蚊子
[考研] 335求调剂 +4 yuyu宇 2026-03-23 5/250 2026-03-23 23:49 by Txy@872106
[考研] 361求调剂 +3 Glack 2026-03-22 3/150 2026-03-23 22:03 by fuyu_
[考研] 化学308分求调剂 +3 你好明天你好 2026-03-23 3/150 2026-03-23 20:11 by macy2011
[考研] 接收2026硕士调剂(学硕+专硕) +4 allen-yin 2026-03-23 6/300 2026-03-23 15:04 by 汪！？！
[考研] 石河子大学（211、双一流）硕博研究生长期招生公告 +3 李子目 2026-03-22 3/150 2026-03-22 21:01 by 怎么释怀
[考研] 306求调剂 +5 来好运来来来 2026-03-22 5/250 2026-03-22 16:17 by BruceLiu320
[考研] 一志愿中南化学（0703）总分337求调剂 +9 niko- 2026-03-19 10/500 2026-03-22 16:08 by ColorlessPI
[考研] A区线材料学调剂 +5 周周无极 2026-03-20 5/250 2026-03-20 21:33 by laoshidan
[考研] 320求调剂0856 +3 不想起名字112 2026-03-19 3/150 2026-03-19 22:53 by 学员8dgXkO
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭