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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 自己的初次蛋白纯化实验
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zy晨曦

新虫 (小有名气)

[交流] 自己的初次蛋白纯化实验 已有2人参与

通过上一次的蛋白纯化，发现酶活的回收率低（目前没有着重考察纯度的问题），所以今天通过降低ph来考察酶活的回收率的问题。通过一天的不间断的实验，发现降低ph能快速洗脱目的蛋白，但是纯化还没有测定。先说说具体的步骤吧。
首先调整了弱阴离子树脂的ph为7.0，还是将树脂倒出然后直接调ph的方法，粗糙而又快速的方法。
调整酶液的ph有点问题，因为利用3M盐酸调整会出现浑浊，主要是因为强酸会导致局部ph过低，酶变性了。所以我利用0.05m的磷酸氢二钾调整ph。成功。
上柱300ml，比上次的柱子上的酶液体积多了100ml，但是酶活略微低于上一个酶液。总体算来，两者的上样量差不多。但是洗脱规律却差了很多
0.2m氯化钠就能洗脱出30%的目的蛋白，0.3m氯化钠在第一个0.5BV时就洗脱出45%的目的蛋白，虽然心里在怀疑这个ph不适合，但是毕竟洗脱出来的酶活高，浓度大，接着0.3M洗脱的第二个0.5BV就没有酶活了，说明洗脱过快。如果可以下次应该改用0.25M洗脱了。接下来的0.4M就没有洗脱出来蛋白。基本在0.3M就洗脱出来了全部的蛋白，但是还是有20%左右的酶活不知道在哪里？酶在和我玩捉迷藏，而树脂一直帮着它，我是孤家寡人了。
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日事日毕，日清日高
1楼 2016-06-06 21:16:20
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hc-material

专家顾问 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
描述的好有意思。
你用的Q的还是DEAE的。
建议清洗直接用0.1M的氯化钠，洗脱用0.35M的氯化钠。PH就用PH7.0的，洗脱的快了是好事啊。另外缓冲液中加20%甘油，可防止酶失活，另外层析过程尽量在低温4度环境中进行，祝顺利
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zy晨曦
2楼2016-06-07 10:09:46
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璧月

捐助贵宾 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
没弄明白为什么把填料弄出来换ph环境？离子交换两种洗脱方法，盐洗脱和ph洗脱。盐是改变环境电导，ph是改变蛋白带电。直接往柱子里泵缓冲液就可以的，为什么要拆出来呢？

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zy晨曦
3楼2016-06-09 14:22:51
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zy晨曦

新虫 (小有名气)
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引用回帖:
2楼: Originally posted by hc-material at 2016-06-07 10:09:46
描述的好有意思。
你用的Q的还是DEAE的。
建议清洗直接用0.1M的氯化钠，洗脱用0.35M的氯化钠。PH就用PH7.0的，洗脱的快了是好事啊。另外缓冲液中加20%甘油，可防止酶失活，另外层析过程尽量在低温4度环境中进 ...

谢谢您的回复，你的建议对我的实验很有帮助，目前我只尝试了7.5和7.0洗脱，还想着再调低pH观察洗脱情况。你觉得有必要再调低ph吗？
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日事日毕，日清日高
4楼2016-06-11 20:03:55
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zy晨曦

新虫 (小有名气)
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引用回帖:
3楼: Originally posted by 璧月 at 2016-06-09 14:22:51
没弄明白为什么把填料弄出来换ph环境？离子交换两种洗脱方法，盐洗脱和ph洗脱。盐是改变环境电导，ph是改变蛋白带电。直接往柱子里泵缓冲液就可以的，为什么要拆出来呢？
...

您好！谢谢您的回复，我现在主要是利用盐洗脱，因为现在使用的是弱阴离子交换树脂，缓冲液是7.5的磷酸盐缓冲液，最初是想着利用0.5M的磷酸盐缓冲液直接冲柱子调节ph,我是怕磷酸根离子结合到树脂柱上。
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日事日毕，日清日高
5楼2016-06-11 20:07:00
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璧月

捐助贵宾 (正式写手)
★
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引用回帖:
5楼: Originally posted by zy晨曦 at 2016-06-11 20:07:00
您好！谢谢您的回复，我现在主要是利用盐洗脱，因为现在使用的是弱阴离子交换树脂，缓冲液是7.5的磷酸盐缓冲液，最初是想着利用0.5M的磷酸盐缓冲液直接冲柱子调节ph,我是怕磷酸根离子结合到树脂柱上。...

改变pH洗脱需要跨越等电点，过等电点1-2个pH单位，让蛋白带电改变。不洗杂的话就直接选择pH低于等电点的缓冲液冲柱子。
盐洗脱就是要让强离子结合在柱子上，把蛋白换下来。我都用氯化钠，用1M的浓度+平衡缓冲拉个盐梯度，然后就知道该用多大浓度的氯化钠洗脱了。
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6楼2016-06-12 09:46:06
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zy晨曦

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 璧月 at 2016-06-12 09:46:06
改变pH洗脱需要跨越等电点，过等电点1-2个pH单位，让蛋白带电改变。不洗杂的话就直接选择pH低于等电点的缓冲液冲柱子。
盐洗脱就是要让强离子结合在柱子上，把蛋白换下来。我都用氯化钠，用1M的浓度+平衡缓冲拉个 ...

我这里的实验条件很简单，只有一个树脂柱，我现在是分段洗脱，发现酶活的回收率总是不高，现在大约在70%左右，目前正在改变上样液和洗脱剂的ph，然后盐洗脱中酶活回收率有所提高。
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日事日毕，日清日高
7楼2016-06-12 20:14:40
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