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zy晨曦新虫 (小有名气)
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[交流]
自己的初次蛋白纯化实验 已有2人参与
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通过上一次的蛋白纯化，发现酶活的回收率低（目前没有着重考察纯度的问题），所以今天通过降低ph来考察酶活的回收率的问题。通过一天的不间断的实验，发现降低ph能快速洗脱目的蛋白，但是纯化还没有测定。先说说具体的步骤吧。 首先调整了弱阴离子树脂的ph为7.0，还是将树脂倒出然后直接调ph的方法，粗糙而又快速的方法。 调整酶液的ph有点问题，因为利用3M盐酸调整会出现浑浊，主要是因为强酸会导致局部ph过低，酶变性了。所以我利用0.05m的磷酸氢二钾调整ph。成功。 上柱300ml，比上次的柱子上的酶液体积多了100ml，但是酶活略微低于上一个酶液。总体算来，两者的上样量差不多。但是洗脱规律却差了很多 0.2m氯化钠就能洗脱出30%的目的蛋白，0.3m氯化钠在第一个0.5BV时就洗脱出45%的目的蛋白，虽然心里在怀疑这个ph不适合，但是毕竟洗脱出来的酶活高，浓度大，接着0.3M洗脱的第二个0.5BV就没有酶活了，说明洗脱过快。如果可以下次应该改用0.25M洗脱了。接下来的0.4M就没有洗脱出来蛋白。基本在0.3M就洗脱出来了全部的蛋白，但是还是有20%左右的酶活不知道在哪里？酶在和我玩捉迷藏，而树脂一直帮着它，我是孤家寡人了。 |
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没弄明白为什么把填料弄出来换ph环境？离子交换两种洗脱方法，盐洗脱和ph洗脱。盐是改变环境电导，ph是改变蛋白带电。直接往柱子里泵缓冲液就可以的，为什么要拆出来呢？ 发自小木虫Android客户端 |
zy晨曦3楼2016-06-09 14:22:51
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