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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » 如何做磷酸化氨基酸位点的突变？求大神指点！
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xczmed

木虫 (初入文坛)

[求助] 如何做磷酸化氨基酸位点的突变？求大神指点！ 已有1人参与

想研究肿瘤细胞中某个兴趣蛋白A干扰后（功能已经验证）是否影响下游蛋白B的磷酸化，有文献报道B 的T423磷酸化可以引起我们验证的功能改变，我想把肿瘤细胞中B蛋白423的T进行突变后看功能表型是否回复，这个怎么做？很困难吗（从没做过这方面实验，需要多长时间能掌握）？请虫友不吝指教！
另：A干扰后B蛋白WB出现了double bands（其中一条保持原位，另一条稍向上移动），我猜想这与磷酸化有关，不知道这个想法是主要因素吗？还应该考虑什么问题？

如何做磷酸化氨基酸位点的突变？求大神指点！
Snap1.jpg@wizardfan@youlinglyw@biostar2009
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1楼 2016-06-01 02:31:13
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花满楼wjy

新虫 (初入文坛)
可以吧T突变成D

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2楼2016-06-01 06:21:24
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花满楼wjy

新虫 (初入文坛)
WB验证磷酸化需要cip处理作为对照，此外，你的图不太好看，要多做做啊

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xczmed
3楼2016-06-01 06:22:52
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xczmed

木虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 花满楼wjy at 2016-06-01 06:21:24
可以吧T突变成D

您好！我写错了，是Y（tyrosine），我看文献上面是将Y 突变成F，用stratagene试剂盒， 因为从来没有做过突变，目前实验室也没有人做类似工作，不知道新人上手需要多久（这个蛋白分子量要130KD左右，我听说大分子更加难做，第一步合成有效表达的质粒就不容易）
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4楼2016-06-02 21:25:37
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xczmed

木虫 (初入文坛)
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引用回帖:
3楼: Originally posted by 花满楼wjy at 2016-06-01 06:22:52
WB验证磷酸化需要cip处理作为对照，此外，你的图不太好看，要多做做啊

另外您说的不好看是指？条带不规整吗？因为是前人的工作，我还需要再重复一下，这个多出来的条带考虑磷酸化对吗？
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5楼2016-06-02 21:27:55
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花满楼wjy

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
4楼: Originally posted by xczmed at 2016-06-02 21:25:37
您好！我写错了，是Y（tyrosine），我看文献上面是将Y 突变成F，用stratagene试剂盒， 因为从来没有做过突变，目前实验室也没有人做类似工作，不知道新人上手需要多久（这个蛋白分子量要130KD左右，我听说大分子更 ...

点突变很好做，不用担心，2天即可，不好看是指条带不是典型的条带，不好看

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6楼2016-06-03 08:09:19
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xczmed

木虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 花满楼wjy at 2016-06-03 08:09:19
点突变很好做，不用担心，2天即可，不好看是指条带不是典型的条带，不好看
...

太感谢了，有没有推荐的教程我能学下如何上手，虽然老板说方法不是问题，但时间有限，还有半年多试验时间，作为新人一头雾水中

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7楼2016-06-04 02:33:53
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花满楼wjy

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
xczmed: 金币+20, ★★★很有帮助 2016-06-08 02:26:51
引用回帖:
7楼: Originally posted by xczmed at 2016-06-04 02:33:53
太感谢了，有没有推荐的教程我能学下如何上手，虽然老板说方法不是问题，但时间有限，还有半年多试验时间，作为新人一头雾水中
...

就是做个PCR，然后用DPNI处理4h，然后转化便可，这个实验DNA聚合酶是关键，现在我们用的是国产诺维赞的酶，很好用。

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8楼2016-06-04 08:13:30
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