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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 分子生理 » 运用crispr/cas9进行基因敲除，pCas质粒总是无法转进感受态中，求大神的指导啊~
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Dugutoufu

铜虫 (初入文坛)

[求助] 运用crispr/cas9进行基因敲除，pCas质粒总是无法转进感受态中，求大神的指导啊~ 已有2人参与

产气肠杆菌与大肠杆菌的同源性很高，理论上可以进行crispr基因敲除，但是我将pCas电转了很多次，还是转不进去，制备的感受态没有问题，质粒浓度大约200ng，电转的条件是：2200V，200Ω，25uF，2mm的电转杯，电转时间大概在5毫秒左右，菌体在抗性板上长，抗性板是kan50，大约18个小时之后能长出菌落。挑取单菌落在同样抗性的液体里也能长，但是再提取质粒验证时，完全提不出来，想请问各路大神这是什么原因啊？做了两个月~~求大神们提提意见@youlinglyw@wizardfan@飞约疯人院@biostar2009
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1楼 2016-05-26 10:21:20
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不爱做实验

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

没做过这个，但是我觉得道理相通：
一般电转之后摇菌，提质粒的效果不如大肠杆菌提的质粒效果好，
尤其是拷贝数低的时候，所以，你可以加大电转后菌液的量再提取。
其实电转后提的质粒，即使你跑胶看不到条带，也可能已经提出来了。
你可以直接用质粒进行PCR验证，看是否p出目标条带。
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11楼2016-08-14 13:04:43
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普通回帖

黄小萌萌

银虫 (小有名气)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-08-15 07:58:02
抗生素有没有失效啊？

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2楼2016-05-26 10:43:35
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黄小萌萌

银虫 (小有名气)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-08-15 07:58:08
卡那霉素做抗生素合理吗？这个菌本身有没有这个抗性基因？

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3楼2016-05-26 10:44:31
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Dugutoufu

铜虫 (初入文坛)
★ ★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-08-15 07:58:14
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-08-15 07:58:33
引用回帖:
2楼: Originally posted by 黄小萌萌 at 2016-05-26 10:43:35
抗生素有没有失效啊？

kan没有失效呢～我的质粒有点大，12.5k

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4楼2016-05-26 19:29:16
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Dugutoufu

铜虫 (初入文坛)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-08-15 07:59:03
引用回帖:
3楼: Originally posted by 黄小萌萌 at 2016-05-26 10:44:31
卡那霉素做抗生素合理吗？这个菌本身有没有这个抗性基因？

这个菌本身是氨苄抗性，pCas是kan抗性，所以不会出现抗性不相容的问题

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5楼2016-05-26 19:31:03
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ken19860823

木虫 (正式写手)
没看明白，你到底在做质粒提取还是做什么

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做基因修饰的老菜鸡
6楼2016-05-27 19:28:01
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18716248350

新虫 (小有名气)
pcas9质粒不是氯霉素抗性吗？

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7楼2016-05-27 22:42:44
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kungfu2016

新虫 (正式写手)
pCas9你有kana抗性的吗？

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8楼2016-05-28 07:24:13
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Bioexperixgs

新虫 (正式写手)
目标菌是什么？质粒扩增菌又是什么？如果你的质粒已经重组到基因组中，那是可能会导致质粒丢失的。

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9楼2016-05-29 09:18:48
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hubuzdw

金虫 (正式写手)
最后转进去没？
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清风吟月,秋水伊人
10楼2016-08-14 12:31:11
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