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体液直接PCR产生引物二聚体，小老板拒绝承认是Primer dimer 已有20人参与
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各位老师， 本人德国某高校小博一枚。 课题是在人体某体液中直接进行PCR（一般情况下体液中有很多PCR抑制物，需要核酸提取过程）， 本人利用一种特殊的酶并对PCR体系进行优化基本实现了实验目标，如图lane 1-7 分别为：ladder；NTC； 50%-10% V/V 体液， 产物234 bp， ladder 50bp。 跟小老板讨论时，他说凝胶下端的条带是什么？ 我说是引物二聚体。 他说no no no， 他的理由是：我用的引物长度都是25 bp， 所以引物二聚体长度应该小于50 bp （我的产物长度大概70 bp）。 另外他说下侧产物信号很强，不像引物二聚体，而像是非特异性的产物 （他认为酶在生产提纯过程中会残留E。coli genomic DNA， 可能与我用的人的引物反应，产生了这个条带）。 另外在no template control 中为什么会有条带产生呢？ 如果我是reviewer， 我不会接收这个工作的。 你有两个选择： 要么去除，要么解释！！！ 之后我查找文献， 发现有文献报道我所用的酶的一个disadvantage就是primer dimer accumulation。 我拿着文献去找小老板，他说文献中下侧的条带没有我的那么强。 你的更像非特异性产物。 。。 然后我对引物浓度进行了梯度测试 0.1um；0.2um；0.3um；0.4um；0.5um each primer。 下侧条带随着引物浓度降低，强度变小。 他又说引物浓度变小，能跟E。coli genomic DNA 结合的引物就少了，所以这不能证明下侧为引物二聚体。。。 下面我打算用大肠试一下，看看是否会和我用的人类的引物反应（我感觉根本就是放屁， 都用primer-blast查过的） 不然就只能测序了 想请问各位老师，您们认为这是引物二聚体吗？ 另外有什么办法能够充分说明他是引物二聚体吗？ 谢谢大家的耐心 祝好  20160509_0428 edta blood_blood factor_6mm_60 degree_45S.jpg |
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如果要论证，其一加做一组实验，模板采用切胶回收带，此外对照组不加模板，其它条件一致，根据条带结果分析。还纠结直接切胶测序 发自小木虫Android客户端 |
9楼2016-05-27 07:36:54
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