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ttt7788

新虫 (正式写手)

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[交流] 体液直接PCR产生引物二聚体，小老板拒绝承认是Primer dimer已有20人参与

各位老师，

本人德国某高校小博一枚。课题是在人体某体液中直接进行PCR（一般情况下体液中有很多PCR抑制物，需要核酸提取过程），本人利用一种特殊的酶并对PCR体系进行优化基本实现了实验目标，如图lane 1-7 分别为：ladder；NTC； 50%-10% V/V 体液，产物234 bp， ladder 50bp。

跟小老板讨论时，他说凝胶下端的条带是什么？我说是引物二聚体。他说no no no，他的理由是：我用的引物长度都是25 bp，所以引物二聚体长度应该小于50 bp （我的产物长度大概70 bp）。另外他说下侧产物信号很强，不像引物二聚体，而像是非特异性的产物（他认为酶在生产提纯过程中会残留E。coli genomic DNA，可能与我用的人的引物反应，产生了这个条带）。另外在no template control 中为什么会有条带产生呢？如果我是reviewer，我不会接收这个工作的。你有两个选择：要么去除，要么解释！！！

之后我查找文献，发现有文献报道我所用的酶的一个disadvantage就是primer dimer accumulation。我拿着文献去找小老板，他说文献中下侧的条带没有我的那么强。你的更像非特异性产物。。。

然后我对引物浓度进行了梯度测试 0.1um；0.2um；0.3um；0.4um；0.5um each primer。下侧条带随着引物浓度降低，强度变小。他又说引物浓度变小，能跟E。coli genomic DNA 结合的引物就少了，所以这不能证明下侧为引物二聚体。。。

下面我打算用大肠试一下，看看是否会和我用的人类的引物反应（我感觉根本就是放屁，都用primer-blast查过的）
不然就只能测序了

想请问各位老师，您们认为这是引物二聚体吗？另外有什么办法能够充分说明他是引物二聚体吗？

谢谢大家的耐心

祝好

20160509_0428 edta blood_blood factor_6mm_60 degree_45S.jpg

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