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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 关于引物设计/荧光定量PCR的几个问题请教一下大家
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mike546

至尊木虫 (正式写手)

Haha

[求助] 关于引物设计/荧光定量PCR的几个问题请教一下大家 已有1人参与

楼主环境专业，初次接触分子实验，提的是植物的RNA，然后反转录成cDNA，再去荧光定量有几个问题想请教一下大家：
（1）提出RNA之后，测了OD260，然后控制每个样品RNA浓度一致，那反转录后还要测280260的比值吗，不测的话，反转录过程会不会有影响？测的话那之前的RNA 的OD260可以不测嘛
（2）引物设计的时候，在NCBI上，进入某个基因的mRNA的详细信息，要把序列复制到设计软件上，那这个序列是这条mRNA的整段序列还是点一下“CDS”然后下面有颜色标注的那一段呢？
（3）如果想做土壤里面的基因，按照这个路线然后去荧光定量可行吗？直接用提DNA的试剂盒提取土壤的DNA为什么不能拿去荧光定量呢？

几个很小白的问题，初次接触，大家见笑了，恳请大家帮帮忙，感激不尽！
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Hiahiahiahia
1楼 2016-05-19 20:00:56
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瘸腿老马

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
问题1，一般只用分光光度计测RNA不测RT后的cDNA，RT后的cDNA要用PCR检测
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2楼2016-05-20 11:14:22
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瘸腿老马

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

问题2，只做定量都可以，那个部位没有区别但序列对PCR影响非常大！
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3楼2016-05-20 11:17:56
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瘸腿老马

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-07-05 06:41:15
xn8008: 金币+1, 应助指数+1, 支持发帖交流 2016-07-05 07:19:57
问题3，用RNA－cDNA可以做定量，直接用DNA也可以做定量，取决于你的目的和样品的丰度是否足够。
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mike546
4楼2016-05-20 11:23:23
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mike546

至尊木虫 (正式写手)

Haha
引用回帖:
2楼: Originally posted by 瘸腿老马 at 2016-05-20 11:14:22
问题1，一般只用分光光度计测RNA不测RT后的cDNA，RT后的cDNA要用PCR检测

你好，请问反转录的时候加的prime mix不是非特异性的嘛，那反转录出来的是整条链吗？
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Hiahiahiahia
5楼2016-05-20 12:43:36
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mike546

至尊木虫 (正式写手)

Haha
引用回帖:
3楼: Originally posted by 瘸腿老马 at 2016-05-20 11:17:56
问题2，只做定量都可以，那个部位没有区别但序列对PCR影响非常大！

你好，您的意思是就选颜色标注的那一段就可以了吗
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Hiahiahiahia
6楼2016-05-20 12:44:06
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mike546

至尊木虫 (正式写手)

Haha
送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by 瘸腿老马 at 2016-05-20 11:23:23
问题3，用RNA－cDNA可以做定量，直接用DNA也可以做定量，取决于你的目的和样品的丰度是否足够。

好的好的，谢谢回答
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Hiahiahiahia
7楼2016-05-20 12:44:22
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winter121

木虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 瘸腿老马 at 2016-05-20 11:23:23
问题3，用RNA－cDNA可以做定量，直接用DNA也可以做定量，取决于你的目的和样品的丰度是否足够。

你好！想请教一下您说的目的是指什么呢，提取RNA反转录成cDNA再用荧光定量PCR测表达差异性的目的是什么呢？而直接用DNA做定量的目的另外是什么呢？

希望表达清楚了。多谢！
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8楼2016-07-04 21:52:23
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winter121

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 瘸腿老马 at 2016-05-20 11:14:22
问题1，一般只用分光光度计测RNA不测RT后的cDNA，RT后的cDNA要用PCR检测

不用电泳检测吗？
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9楼2016-07-04 21:53:21
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