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guoxingjun2008金虫 (正式写手)
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关于测序的问题！！
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现在提取DNA要去测序，我们的程序是这样的： 首先提取DNA，电泳检测； 然后PCR扩增 再把PCR扩增产物连接到T载体，接着转化感受态细胞，之后涂板，挑取白色菌落后就送去测序！ 请做过这方面的朋友，看看实验步骤有没有什么问题！ 谢谢！ |
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2楼2008-10-31 17:27:22
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在平板上长出菌落后一定要挑去出来进行验证。不管你是用蓝白斑筛选还是用抗生素来筛选。 我们所使用的T载体都是在pUC质粒及基础上进行改造的出来的。生物制品公司把pUC质粒酶切开后在两端加上末端是T的接头，记住接头的添加率并非是百分之百！ 平板筛选是可以使用菌落PCR也可以使用酶切验证。菌落PCR比较快，便于进行大量转化子的筛选，但是存在出现假阳性的可能性，使用菌落PCR一定做好阴性对照。酶切验证是很可靠的一种方法，但是你如果使用的是那种没有酶切位点的T载体就无法使用酶切法进行验证。 得到阳性克隆后在送公司测序前最后进行一次划线分离，确定你送去测序的是单克隆，当然从平板上挑去的但菌落大多数时候是单克隆但非绝对，如果你遇上不是单克隆的情况，你测序的峰会不好，影响你的测序结果！ 测序现在大多数都是交给公司来做了，一个反应几十块钱，测序完发到你邮箱。快速方便。自己测序好像还得买试剂盒。 个人观点，仅供参考！ |
8楼2008-11-10 12:59:54
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