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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 构建重组质粒转化到大肠DH5a感受态中
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sh727986091

金虫 (小有名气)

[求助] 构建重组质粒转化到大肠DH5a感受态中 已有2人参与

DH5a转化后培养21h才长出1-2个菌落，是怎么回事，这会是阳性结果吗？菌落还很小，只是一个小点。
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1楼 2016-05-16 09:13:47
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

18716248350

新虫 (小有名气)
有时候要看你质粒，之前我导一个质粒培养了1夜多没长我就扔了，做了很多次都没做出来。后来我上上周又做，把平板放37摄氏度放了3天，我都以为不会长了，结果先于阴影长了两个出来，我就把两个挑出来密集划12格那种小的密集划线长出来后接到液体中提质粒，居然提出来了。所以你把那个菌等它再长大点试试。有可能是成功的，但是前提是阴性没有长

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9楼2016-05-17 19:11:47
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安静de执着14

新虫 (著名写手)
这个原因应该挺多吧，比如你的抗生素浓度太大，或者你的质粒没有构建成功，或者是假阳性等。是不是你要的结果，挑单菌落培养，然后提质粒酶切就好了。

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2楼2016-05-16 09:41:07
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030Selma

金虫 (正式写手)
可能你的感受态不行了

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3楼2016-05-16 10:12:10
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守望海贝

捐助贵宾 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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sh727986091: 金币+3, ★★★很有帮助 2016-05-17 18:24:47
感受态细胞不行或者抗生素加多了，可以挑菌落培养后提取质粒进行PCR和酶切、测序鉴定，若正确的话，后续需要表达蛋白什么的，把提取的质粒重新转新的感受态细胞，挑单菌落培养菌液，保菌
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4楼2016-05-16 10:53:40
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sh727986091

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 守望海贝 at 2016-05-16 10:53:40
感受态细胞不行或者抗生素加多了，可以挑菌落培养后提取质粒进行PCR和酶切、测序鉴定，若正确的话，后续需要表达蛋白什么的，把提取的质粒重新转新的感受态细胞，挑单菌落培养菌液，保菌

之前用这批感受态细胞做过一次转化，空白对照没有菌落，转化的LB平板上长了50多个菌落，但是菌落PCR和试剂盒提取质粒跑出的电泳都没有条带，很是奇怪，可能存在的一个问题是挑取单菌落扩大培养的时候没有在LB液体培养基中加入Amp，从而导致后续传代过程中质粒丢失，但是也不至于全部丢失吧？而且我也从筛选平板上直接挑菌做了菌落PCR，还是没能P出条带。这次的转化培养了那么长的时间又只长出了2~3个菌落，而且生长极其缓慢，现在已经超过24h，菌落直径目测还是只有0.5mm那么大。唉，已经做了两三个星期了，构建重组质粒转化这一关一直过不去，真是郁闷！
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5楼2016-05-16 21:25:36
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sh727986091

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 030Selma at 2016-05-16 10:12:10
可能你的感受态不行了

这批感受态是不久前制备的，已经验证过多次，之前也有怀疑过，不过现在已排除。
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6楼2016-05-16 21:27:17
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守望海贝

捐助贵宾 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by sh727986091 at 2016-05-16 21:25:36
之前用这批感受态细胞做过一次转化，空白对照没有菌落，转化的LB平板上长了50多个菌落，但是菌落PCR和试剂盒提取质粒跑出的电泳都没有条带，很是奇怪，可能存在的一个问题是挑取单菌落扩大培养的时候没有在LB液体培 ...

做连接转化这步用的东西全部换掉，重做一遍，正常情况12-16h就可以明显看到菌落
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7楼2016-05-17 08:56:38
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sh727986091

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 守望海贝 at 2016-05-17 08:56:38
做连接转化这步用的东西全部换掉，重做一遍，正常情况12-16h就可以明显看到菌落...

好的，谢谢！

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8楼2016-05-17 18:21:54
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sh727986091

金虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 18716248350 at 2016-05-17 19:11:47
有时候要看你质粒，之前我导一个质粒培养了1夜多没长我就扔了，做了很多次都没做出来。后来我上上周又做，把平板放37摄氏度放了3天，我都以为不会长了，结果先于阴影长了两个出来，我就把两个挑出来密集划12格那种小 ...

好的，谢谢！我再试试看。

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10楼2016-05-18 08:33:35
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